Definición de la N filarial

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7951 (2023) Citar este artículo

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La glicosilación ligada a N es una modificación postraduccional crítica de las proteínas eucariotas. Los glicanos ligados a N están presentes en la superficie y secretan proteínas filáricas que desempeñan un papel en las interacciones del huésped con el parásito. Se han identificado previamente ejemplos de proteínas glicosiladas de Brugia malayi, pero no se ha realizado un estudio sistemático del glicoproteoma unido a N de este o cualquier otro parásito filarial. En este estudio, aplicamos un protocolo FASP N-glico mejorado utilizando una proteína de unión a carbohidratos diseñada, Fbs1, para enriquecer los péptidos N-glicosilados para el análisis mediante LC-MS/MS. Luego mapeamos los N-glicositos en proteínas de tres etapas del huésped del parásito: hembra adulta, macho adulto y microfilarias. El enriquecimiento de Fbs1 de péptidos N-glicosilados mejoró la identificación de N-glicositos. Nuestros datos identificaron 582 glicoproteínas unidas a N con 1273 N-glucositos. La ontología génica y la predicción de la localización celular de las N-glucoproteínas identificadas indicaron que en su mayoría eran proteínas extracelulares y de membrana. Comparando los resultados de gusanos hembra adultos, gusanos macho adultos y microfilarias, encontramos variabilidad en la N-glicosilación a nivel de proteína, así como a nivel individual de N-glicosito. Estas variaciones se destacan en las glicoproteínas N de la cutícula y las glicoproteínas N restringidas del gusano adulto como ejemplos de proteínas en la interfaz del parásito huésped que están bien posicionadas como posibles dianas terapéuticas o biomarcadores.

Brugia malayi es uno de los tres parásitos filariales humanos que causan la filariasis linfática, una enfermedad tropical debilitante y crónica desatendida que actualmente amenaza a más de 859 millones de personas en 50 países en todo el mundo1,2. Los síntomas en las personas pueden variar de leves a graves, incluido el daño al sistema linfático y los riñones, y la eventual obstrucción de los vasos linfáticos con inflamación de los genitales y las extremidades1,2. Los gusanos adultos que residen en el sistema linfático de individuos inmunocompetentes pueden sobrevivir un promedio de 6 a 8 años. Las lombrices hembras liberan millones de microfilarias (larvas inmaduras), que se abren camino hacia el torrente sanguíneo, donde pueden ser ingeridas por los mosquitos que se alimentan, el insecto vector de estos parásitos. Dentro de los mosquitos, las microfilarias mudan y se desarrollan a través de varias etapas hasta llegar a la tercera etapa larvaria infectiva (L3) que luego puede transmitirse a través de una comida de sangre a otros humanos. Estas larvas L3 luego mudan y maduran a medida que migran al sistema linfático donde completan el ciclo de vida1,2. Se han entregado más de 7 mil millones de tratamientos en 66 países para combatir la filariasis linfática como parte del esfuerzo de la OMS para eliminar la enfermedad1,3. Los tratamientos actuales, si bien son efectivos para reducir la transmisión al reducir o eliminar las microfilarias que circulan en la sangre, no matan a los gusanos adultos responsables de los síntomas asociados con la filariasis3,4. Además, se han realizado informes de resistencia emergente a los tratamientos actuales5,6. Para expandir las medidas de control disponibles, se necesitan estudios adicionales para aumentar las opciones de medicamentos disponibles y los objetivos de medicamentos.

Las interacciones mediadas por parásitos con el huésped mamífero, como la inmunomodulación y la evasión inmunitaria, permiten que B. malayi y otros parásitos filariales existan durante muchos años en huéspedes inmunocompetentes y representan un área activa de investigación7. Los glicoconjugados presentes en la superficie del gusano, secretados, excretados o presentes en vesículas extracelulares liberadas por el parásito en el huésped son parte de mecanismos cruciales que permiten que estos parásitos existan durante años sin eliminación8,9,10,11. La caracterización detallada de estas moléculas críticas y sus vías de síntesis puede resaltar biomarcadores candidatos, objetivos terapéuticos, moléculas de vacunas o herramientas de diagnóstico para un mayor desarrollo. Por ejemplo, la prueba diagnóstica actual para la filariasis linfática es la detección del antígeno filarial circulante de Wuchereria bancrofti mediante un anticuerpo monoclonal12. Estudios recientes mostraron que el epítopo reconocido es un glicano y se necesitan estudios adicionales para caracterizar completamente la estructura13.

Una clase importante de glicoconjugados son las proteínas N-glucosiladas o las glicoproteínas N-ligadas. La N-glicosilación es una modificación postraduccional compleja en la que los glucanos se unen al nitrógeno de residuos de asparagina específicos en una proteína y desempeñan un papel en muchos procesos biológicos, incluido el plegamiento, la estabilidad y la función de la proteína14. Los ejemplos de las funciones que desempeña la N-glicosilación en las interacciones del patógeno huésped están bien establecidos en los virus e incluyen protección para permitir la evasión inmunitaria, aumentar la infectividad y cambiar la virulencia15. En particular, las N-glucoproteínas de superficie que protegen al virus del sistema inmunitario del huésped incluyen la glucoproteína de hemaglutinina de influenza16, la proteína de espiga de la cubierta del VIH-1 (gp120/gp41)17 y la proteína de espiga del SARS-CoV218. Estrategias similares pueden desempeñar un papel en los parásitos metazoarios. Además, la matriz y la modularidad de los N-glucanos confieren un nivel de diversidad que el parásito puede aprovechar para la heterogeneidad a corto o largo plazo, como se demostró recientemente para Acanthocheilonema viteae ES-6219, y probablemente sea importante para las interacciones del huésped con el parásito14, 20 Se cree que estas proteínas del N-glucoproteoma adaptables y modificadas postraduccionalmente evolucionan más que el proteoma del organismo y tienen menos conservación con otras especies21. Por lo tanto, se espera que el N-glucoproteoma del parásito filarial incluya N-glucoproteínas de superficie específicas para el estilo de vida del parásito y críticas para las interacciones con el huésped mamífero.

For parasitic nematodes, the host parasite interface can be defined as the cuticle or outer exoskeleton covering of the worm, excretory-secretory (ES) components, and extracellular vesicles. Early studies of filarial worm cuticle proteins identified two B. malayi glycoproteins. gp29 (Bm2151) is a major surface glycoprotein found in the cuticle of adult worms with homology to the glutathione peroxidases that are part of the oxidative stress response22. gp15/400 (Bm6083 or Bm6084, Bma-npa-1) is a nematode polyprotein allergen related glycoprotein found in the cuticle of the adult worms and is thought to play a role in acquiring the required fatty acids that the worms cannot synthesize de novo22,23. Recently, gp15/400 was described as an immunodominant antigen targeted by human IgE monoclonal antibodies produced from parasite infected human sera24. Later studies broadened the number of cuticle associated proteins but little is known about their glycosylation status25. ES-62 (Bm9816) is a major secreted glycoprotein in filarial nematodes26,27 and of special interest due to immunomodulatory phosphorylcholine substitution of its N-glycans8,9,26. Larger proteomic studies of excreted and secreted proteins28,29, extracellular vesicle proteins30 and membrane or surface enriched proteins31 highlighted more proteins that are exposed to the mammalian host. However, the possibility of glycan-mediated interactions with the host were not addressed in these strictly proteomic analyses. N-linked glycosite mapping in Caenorhabditis elegans, a soil living nematode, identified 829 N-linked glycoproteins in one study and 1010 N-linked glycoproteins in a second21,32. These studies that identified over a thousand N-glycoproteins included all stages (egg, L1, L2, L3, L4, and adult worms) of the nematode life cycle (2015)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR33" id="ref-link-section-d12369696e568">33. Un mapeo reciente de glucositos de un nematodo parásito Clade V34, Haemonchus contortus, identificó 291 glucoproteínas unidas a N35 de solo una muestra mixta de gusanos adultos.

Aquí, utilizamos y ampliamos estos hallazgos al identificar y mapear los N-glicositos de proteínas de B. malayi de lisados ​​totales preparados a partir de gusanos hembra adultos, gusanos macho adultos y microfilarias para caracterizar el N-glicoproteoma y explorar más a fondo las proteínas en el interfaz de las interacciones del parásito huésped filarial. Significativamente, mostramos que nuestros datos incluyen ejemplos conocidos de proteínas que interactúan con la cutícula y el parásito inmunomodulador del huésped. También destacamos dos grupos diferentes de N-glicoproteínas. El primer conjunto es un grupo de N-glucoproteínas que tienen diez o más N-glucositos. Utilizamos este conjunto para explorar la variación de ocupación de N-glucositos entre los tres tipos de muestras estudiados. El segundo conjunto es un grupo de N-glicoproteínas que son exclusivos de los gusanos adultos hembras y machos adultos. Utilizamos este conjunto para explorar proteínas específicas de filarias y nematodos.

Aproximadamente 200 gusanos hembra, 100 gusanos macho o 2 millones de microfilarias (TRS Labs Inc., Athens GA) se resuspendieron en tampón de lisis (100 mM Tris HCl pH 7,5, 100 mM DTT, 4% SDS (v/v)) a 10 ml por 0,3 g de gránulo húmedo de lombrices. Para comenzar la lisis, las muestras se congelaron en hielo seco durante 10 min y luego se descongelaron a 37 °C cuatro veces antes de la homogeneización con un homogeneizador Dounce de vidrio. Luego, las muestras homogeneizadas se calentaron a 100 °C durante 5 min y luego se enfriaron en hielo. Los desechos celulares y las células intactas se sedimentaron a 15 000 × g durante 10 min. La concentración de proteínas de cada sobrenadante se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce™ 660 nm (ThermoFisher Scientific, Waltham MA).

Los péptidos trípticos se produjeron como se describió previamente36. En resumen, se intercambió un máximo de 400 µg de cada lisado de proteínas en tampón de urea (Tris HCl 100 mM, pH 8,2, Urea 8 M) utilizando filtros centrífugos Microcon 30 K (Millipore Sigma, Burlington, MA). A esto le siguió la alquilación de los residuos de cisteína con yodoacetamida 50 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en el mismo tampón de urea en la oscuridad durante 20 min. Se eliminó por lavado el exceso de yodoacetamida y luego se cambió de nuevo el tampón, esta vez por bicarbonato de amonio 50 mM. A continuación, la mezcla de proteínas se digirió con tripsina (P8101S, New England Biolabs, Ipswich, MA) en una proporción de 1:100 de enzima a proteína a 37 °C durante la noche y se recogieron los péptidos resultantes. La concentración de péptidos se determinó mediante el kit de cuantificación de ensayo colorimétrico de péptidos Pierce. (ThermoFisher Scientific).

Los N-glucopéptidos se enriquecieron como se describió anteriormente37. En resumen, se mezclaron 100 µg de mezcla de péptidos de lisado total con 200 µg de Fbs1 GYR en un filtro centrífugo Microcon 30 K y se incubaron a 4 °C durante 2 h. Los péptidos no unidos se eliminaron por centrifugación. Después de lavar para asegurar que se eliminaron todos los péptidos no unidos, los péptidos N-glicosilados enriquecidos se eluyeron con ácido fórmico al 50%. A continuación, la elución se liofilizó para eliminar el ácido fórmico y el agua.

Los péptidos de 100 µg de mezcla de péptidos totales liofilizados (Total) o la mezcla de péptidos enriquecida con Fbs1 GYR (Fbs1) de 100 µg de mezcla de péptidos totales iniciales se resuspendieron en bicarbonato de amonio 100 mM preparado con agua 18O (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA ). Se añadieron 1000 unidades de tampón PNGase F (P0704, New England Biolabs) intercambiadas en bicarbonato de amonio 100 mM preparado con agua 18O a una reacción final de 50 µl que contenía una mezcla de péptidos Total o Fbs1. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Las muestras se procesaron inmediatamente en LC-MS/MS como se indica a continuación para evitar eventos de desamidación química falsos.

Los péptidos de cada una de las seis muestras se analizaron mediante espectrometría de masas. Para cada muestra, el 6 % del volumen de péptido resultante se cargó en una columna analítica de fase inversa (columna UHPLC Ion Opticks Aurora, 25 cm × 75 µm ID, 1,6 µm C18) mediante un Proxeon Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific). La columna se alojó en un horno de columna Sonation (Sonation Lab Solutions) y se mantuvo a 50 °C. Los péptidos se eluyeron durante una ventana de tres horas que constaba de un gradiente lineal de 156 minutos del 2 al 35 % de B, un gradiente de tres minutos al 85 % de B y un flujo isocrático al 85 % de B durante siete minutos en los que la fase móvil A era agua. que contenía ácido fórmico al 0,1 % y la fase móvil B era acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 0,1 %. Los péptidos eluidos se introdujeron en un espectrómetro de masas Q Exactive (Thermo Scientific) mediante electropulverización utilizando una fuente de iones Nanospray Flex (Thermo Scientific) a un caudal de 400 nl/min. Los diez iones más abundantes de cada exploración completa (resolución de 70 k, rango de exploración de 400 a 1600 m/z) se seleccionaron para la fragmentación mediante HCD (disociación por colisión de mayor energía) y los espectros de fragmentación se adquirieron con una resolución de 35 k. Se utilizó una energía de colisión normalizada escalonada de 20, 30 y 40. Se excluyeron los estados de carga de uno y mayores de ocho. La exclusión dinámica se estableció en 30 s. Cada muestra se analizó con tres réplicas técnicas y los espectros de cada conjunto por triplicado se combinaron para el análisis.

Los datos espectrales se buscaron en el proteoma combinado de B. malayi (brugia_malayi.PRJNA10729.WBPS10.protein.fa) de Wormbase38 y el endosimbionte Wolbachia del proteoma de B. malayi de NCBI39, ambos descargados en diciembre de 2019 y luego analizados con el software Byonic (Protein Metrics , Cupertino, CA). Los contaminantes comunes como queratinas, caseínas, tripsina y BSA se eliminaron del análisis. La producción de proteína se fijó en 1% FDR. Otros parámetros utilizados para cada conjunto de datos de espectrometría de masas fueron sitio de escisión = RK, lado C-terminal = semiespecífico; escisión perdida = 2; Tolerancia de masa = 10 ppm; Fragmentación QTOF/HCD con tolerancia de masa de fragmento de 0,02 Da. Modificaciones fijas = carbamidometilo @ C/ + 57.021464. Modificaciones variables = desamidado:18O(1) / + 2,988261 @ N, oxidación/ + 15,994915 @ M, desamidado / + 0,984016 @ N y Q, acetilo @Protein N-term / + 42,010565, Gln- > piro-Glu/ -17,026549 , amidada @ D y E / -0.984016. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE40 con el identificador de conjunto de datos PXD039002 y 10.6019/PXD039002.

Filtramos los resultados de tal manera que se requería que los péptidos tuvieran una puntuación Byonic > 200 y una longitud de péptido > 4 para las muestras enriquecidas con Fbs1. Para las muestras totales, que tenían una mayor complejidad, utilizamos una puntuación de Byonic de > 300 y una longitud de péptido > 4. La puntuación de Byonic es un indicador de la precisión de la coincidencia del espectro de péptidos41. Los péptidos únicos únicos que se asociaron a una sola proteína, en una réplica de la muestra, y que no estaban presentes en las cinco muestras restantes, están marcados con un asterisco en la Tabla complementaria S1 y no se incluyen en análisis de datos adicionales. Para comparar las proteínas identificadas por LC-MS/MS con estudios proteómicos publicados previamente28,29,30,31,42,43 que utilizaron diferentes identificaciones de proteínas, cruzamos las bases de datos Wormbase38 y UniProt44 para correlacionar la identificación de Wormbase de nuestros datos con PUB_loci /pub_locus o a UniProtKB ID para el proteoma de B. malayi y a la base de datos UniProt para correlacionar NCBI ID con UniProtKB ID o números de genes wBm para el proteoma de Wolbachia. Los sinónimos que encontramos asociados con cada proteína en nuestro conjunto de datos utilizados para las referencias cruzadas se enumeran en la Tabla complementaria S2.

We used NetNGlyc-1.046 to find the canonical N-X-S/T glycosites present in each N-glycoprotein. We used Weblogo47 to create a sequence logo for extracted -10 to + 10 amino acid sequences. We used BioVenn48 to generate a proportional Venn diagram. We used TMHMM-2.049 to predict transmembrane domains. We used UpsetR50 to generate UpsetR intersecting set plots. The gene ontology identification and functional enrichment analysis was performed using g:Profiler (version e105_eg52_p16_e84549f.) with g:SCS multiple testing correction method applying significance threshold of 0.0551. We used ggplot (2016)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR52" id="ref-link-section-d12369696e755"> 52 para generar diagramas de dispersión a partir del análisis de datos de enriquecimiento de genes. Usamos DeepLoc para predecir la localización subcelular de cada N-glicoproteína53. Utilizamos Parasite Biomart en Wormbase para buscar ortólogos de C. elegans y H. contortus para identificar N-glucoproteínas de B. malayi54. Usamos Clustal Omega para generar una alineación de secuencia múltiple55.

El método mejorado de N-glico FASP utiliza un mutante Fbs1-GYR que se une específicamente a péptidos N-glicosilados. Esta proteína diseñada es selectiva para una amplia gama de glucopéptidos unidos a N y demostró tener un enriquecimiento 2,2 veces mayor y menos sesgo en comparación con el protocolo N-glucoFASP estándar que utiliza una combinación de lectinas ConA, WGA y RCA12037. También se demostró que el método de enriquecimiento de Fbs1 es más adecuado para el análisis de N-glicositos que los métodos menos selectivos (HILIC o hidrazida) que permiten el enriquecimiento de glicanos ligados a O u otras moléculas hidrófilas37.

Analizamos muestras tratadas con PNGase F en presencia de agua 18O de muestras de proteoma total no enriquecidas (total) y muestras de enriquecimiento posterior a Fbs1 (Fbs1) mediante LC-MS/MS para gusanos hembra adultos, gusanos macho adultos y microfilarias. La PNGasa F es una N-glucosidasa peptídica que libera específicamente oligomanosa, glucanos híbridos y glucanos complejos unidos a una asparagina mediante la escisión en el enlace amida56. La escisión del glucano con PNGasa F en agua 18O genera un evento de desamidación cuando la asparagina se convierte en ácido aspártico con la incorporación de 18O. Esto da como resultado una adición de + 2,98 Dalton en la secuencia de aminoácidos primaria del péptido57 fácilmente detectada por espectrometría de masas. Los péptidos que contienen una asparagina con esta adición de +2,98 Dalton se denominan en lo sucesivo péptidos N+3. Sin agua 18O, la escisión de la PNGasa F da como resultado una desamidación de + 0,98 Dalton que también puede ser el resultado de una desamidación espontánea no deseada de la asparagina durante el procesamiento de la muestra. Aunque la PNGasa F no puede liberar N-glicanos cuando la fucosa α (alfa) 1–3 está presente en el núcleo N-acetil glucosamina (GlcNAc) de un N-glicano, no usamos una segunda enzima como PNGasa A porque α La fucosilación (alfa) 1-3 del núcleo GlcNAc está ausente en B. malayi58 y otros nematodos filariales59.

La utilidad del enriquecimiento de Fbs1 se ilustra en la Fig. 1a, donde se resume el número y el porcentaje de coincidencias del espectro de péptidos con y sin una modificación N+3 en cada muestra. Los datos completos se pueden encontrar en la Tabla complementaria S1. Como se detalla en la sección "Materiales y métodos", para garantizar que pudiéramos comparar las muestras, normalizamos las entradas determinando la concentración de péptidos para todas las muestras antes del enriquecimiento. El enriquecimiento de Fbs1 mejora tanto el número total de péptidos N-glicosilados como la calidad de los datos. Sin enriquecimiento, el número de péptidos N+3 en las muestras totales se limita al 1 % al 3 % de todos los péptidos. Incluso con decenas de miles de péptidos identificados en las muestras totales, el número final de péptidos N + 3 identificados se encuentra entre 45 y 241, con la menor presencia en la muestra de gusanos macho. Las muestras enriquecidas con Fbs1, por el contrario, tienen de 213 a 1366 péptidos N+3 que representan un aumento de cuatro a cinco veces en los datos de péptidos N+3 disponibles en comparación con las muestras totales. Además, para definir los péptidos N + 3 como N-glicositos, requerimos un motivo canónico de sitio de N-glicosilación, NXS/T, donde X podría ser cualquier aminoácido que no sea prolina21. (En lo sucesivo, la secuencia NXS/T se denominará N-glicosito canónico y un péptido N + 3 con un sitio de N-glicosilación canónico se denominará N-glicosito identificado. Los N-glicositos específicos identificados se enumerarán con la posición de la asparagina en la secuencia de aminoácidos seguida de su secuencia NXS/T, por ejemplo, 67 NET) Por lo tanto, para ser un N-glicosito identificado, todos los N + 3 péptidos se evaluaron para incluir un N-glicosito canónico y se anotaron en la Fig. 1a en naranja. Estos resultados ejemplifican el poder y la utilidad del método de enriquecimiento de Fbs1 para identificar N-glicositos, ya que existe una alta concordancia de la modificación N + 3 con un N-glicosito canónico en las muestras enriquecidas con Fbs1. En las tres muestras de Fbs1, entre el 74% y el 87% de todos los péptidos de la muestra tienen una modificación N + 3 presente en un N-glicosito canónico. La figura 1c se centra en los péptidos con modificación N + 3 y muestra que el porcentaje de péptidos modificados con N + 3 con un N-glicosito canónico en las muestras de Fbs1 es del 98 al 99 %. En el Total de muestras con mayor complejidad muestral, la concordancia es sustancialmente menor. Como era de esperar, solo del 0,7 % al 1,6 % de todos los péptidos en estas muestras no enriquecidas tienen una modificación N + 3 presente en un N-glucosito canónico (Fig. 1a). Sin embargo, incluso cuando solo se analizan los péptidos con una modificación N + 3, solo el 51-84 % de los péptidos modificados con N + 3 en las muestras totales se encuentran con una N-glicosita canónica (Fig. 1c). Este fondo mayor es a pesar de un umbral de puntuación Byonic más alto para los péptidos de las muestras totales que se utilizan para aumentar la rigurosidad. En consecuencia, el enriquecimiento de péptidos por Fbs1 aumenta el número de N-glicositos identificados y disminuye el fondo.

Enriquecimiento de Fbs1. Cada barra representa la media de las coincidencias del espectro de péptidos en (a) o la media de las proteínas identificadas en (b) de las muestras Total (sin enriquecimiento) o enriquecidas con Fbs1 para gusanos hembra, ♀, gusanos macho, ♂ y microfilarias, Mf. En gris claro, etiquetados como Non N+3, están los péptidos o proteínas sin la modificación N+3. En gris oscuro, etiquetados como N + 3: Otros, son los péptidos o proteínas que contienen N + 3 no canónicos sin un glicosito NXS/T. En naranja N + 3: NXS/T son los péptidos o proteínas de N-glicosito con una modificación N + 3 y un glicosito NXS/T canónico asociado. El porcentaje en gris oscuro junto a la barra representa el N+3: Otro porcentaje en toda la muestra. El porcentaje en naranja junto a la barra representa los péptidos o proteínas N + 3: NXS/T en toda la muestra. Los gráficos circulares representan el porcentaje de Otro frente a NXS/T para los péptidos N+3 en (c) o las proteínas que contienen péptidos N+3 en (d).

Los resultados del enriquecimiento de Fbs1 se reflejan cuando se observan los resultados a nivel de proteína. Las proteínas identificadas por un solo péptido único en solo una réplica de las seis muestras se excluyeron de nuestro análisis (Tabla complementaria S1, * péptidos individuales). En las muestras enriquecidas con Fbs1, un mayor porcentaje de proteínas tenía una modificación N + 3 y oscilaba entre el 78 y el 88 %, como se ve en la Fig. 1b. Por el contrario, en las muestras totales, la modificación N + 3 solo se encontró en el 4% de las proteínas del gusano macho y en el 13-18% de las proteínas del gusano hembra y microfilarial. Para las muestras totales, la Fig. 1d muestra que había números relativamente similares de proteínas que contenían péptidos N+3 sin un N-glucosito canónico como los que había con una secuencia NXS/T. Con el enriquecimiento de Fbs1, solo del 1 al 6% de las proteínas tenían péptidos N + 3 sin un N-glucosito canónico. Esto da como resultado cuatro a cinco veces más proteínas N-glicosiladas identificadas en muestras enriquecidas con Fbs1 frente a muestras totales o no enriquecidas con cantidades de entrada equivalentes analizadas.

En total, se identificaron más de 2000 proteínas diferentes en las seis muestras analizadas (Tabla complementaria S2). Después de extraer todas las proteínas con una modificación N + 3 y de requerir un N-glicosito canónico, identificamos 582 N-glicosiladas con 1273 N-glicositos (Tabla complementaria S3). Cabe señalar que estos datos se generaron a partir de réplicas técnicas de una muestra agrupada de gusanos hembra, gusanos macho y microfilarias. En comparación, con más de 1000 N-glucoproteínas en los N-glucoproteomas21,32 de C. elegans que abarcan todas las etapas de la vida y el N-glucoproteoma de H. contortus con 282 N-glucoproteínas35 que representan muestras de gusanos adultos, creemos que este B. malayi N -glicoproteoma de muestras de gusanos adultos y microfilarias proporciona una buena instantánea del N-glicoproteoma filarial presente en la etapa de huésped mamífero.

Como es común con otros N-glucoproteomas estudiados, la distribución de N-glucositos favoreció a NXT con 791 sitios (62%) en comparación con NXS con 482 sitios (38%)21. Extrajimos las secuencias 10 aminoácidos aguas arriba y aguas abajo de los N-glucositos identificados para buscar motivos conservados adicionales47 (Tabla complementaria S3, Figura complementaria S1). Los datos mostraron el NXS/T esperado donde X podría ser cualquier aminoácido excepto prolina y sin motivos adicionales. Se encontraron proteínas del endosimbionte de Wolbachia en las muestras, pero como era de esperar, no identificamos ninguna de ellas como N-glucoproteínas (Tabla complementaria S2).

El 53 % de las N-glucoproteínas tienen un glucosito unido a N, mientras que el resto tiene dos o más glucositos unidos a N (Fig. 2a). Ocho proteínas tenían diez o más glucositos unidos a N y se enumeran en la Tabla 1. Estas proteínas altamente glicosiladas demuestran el mayor número de N-glucositos que se pueden descubrir mediante el enriquecimiento de Fbs1. Para las ocho proteínas, hay más N-glicositos identificados en las muestras de Fbs1 que en las muestras totales. Aunque el mayor número de N-glicositos revelado por el enriquecimiento de Fbs1 es evidente en las proteínas altamente glicosiladas, esta tendencia sigue siendo la misma para la mayoría de las N-glicoproteínas. De hecho, solo el 33 o el 2,6% de los 1273 N-glucositos se encontraron exclusivamente en las muestras Total pero no en las muestras Fbs1. Estas pocas proteínas se indican con un asterisco en las columnas de muestra de la Tabla complementaria S3.

N-glucoproteínas (a) La distribución de N-glucoproteínas que tienen de 1 a 10 + N-glucositos. ( b ) Comparación de superposición del diagrama de Venn proporcional al área de las 582 glicoproteínas N identificadas a partir de cantidades estandarizadas de gusanos hembra B. malayi, gusanos macho y microfilarias analizadas en este estudio.

Otra característica notable en la Tabla 1 es la variabilidad en la ocupación de N-glucositos entre las muestras. El total de N-glucositos identificados en las seis muestras se enumera en la sexta columna etiquetada Todo. La comparación de este total con los N-glicositos encontrados en las muestras individuales muestra la variación de N-glicositos entre estas muestras. Para dos proteínas, Bm2376a y Bm6131, el total de N-glicositos identificados coincide con el total encontrado en las microfilarias. Sin embargo, un subconjunto más pequeño de estos N-glucositos se encuentra en gusanos machos y hembras adultos. Para las otras seis proteínas, hay una mezcla de N-glucositos individuales y superpuestos que suman el número total de todas las muestras.

La Figura 3 ilustra la variabilidad en la ocupación de N-glicosito para Bm7191. Se prevé que esta proteína sea una proteína de membrana con los primeros 604 aminoácidos de la proteína orientados fuera de la membrana y una única región transmembrana del 605 al 627 resaltada en gris60. Tiene 22 N-glicositos canónicos, todos encontrados dentro de la región que se predice que está fuera de la membrana46. Si bien se identificaron un total de 12 N-glicositos, el mapeo de la secuencia de proteínas muestra que solo un sitio en 67 NET está ocupado en gusanos hembra, gusanos macho y microfilarias. En las microfilarias, dos N-glicositos a 26 NGS y 145 NKT están ocupados de manera única y en los gusanos hembra, otros dos N-glicositos a 120 NFT y 443 NDS están ocupados de manera única. Los siete sitios restantes están ocupados tanto por gusanos hembra como por microfilarias. Dos sitios en 345 NAS y 443 NDS estaban por debajo del umbral establecido para la predicción de N-glucositos, pero se identificaron como N-glucositos, lo que muestra que es posible que sea necesario reducir el umbral para la predicción de N-glucositos en algunos casos. La variabilidad en la ocupación de N-glucositos debe explorarse más a fondo para determinar su importancia biológica.

Ocupación de N-glicosito de Bm7191: La secuencia de proteína completa de Bm7191 se muestra con la región transmembrana predicha resaltada en gris49. Los sitios NXS/T están coloreados de azul en la secuencia de proteína si se pronosticaron como un N-glucosito y de color rojo si no se alcanzó el umbral determinado por acuerdo del jurado utilizando nueve redes neuronales y una puntuación superior al umbral establecido por NetNGlyc-1.046. Los N-glucositos que se encuentran en los gusanos hembra (de color rojo ♀), los gusanos macho (de color verde ♂) y las microfilarias (mf de color azul) se indican arriba de la secuencia.

La superposición de proteínas que se observa que están N-glicosiladas en machos, hembras y microfilarias se muestra en la Fig. 2b. Mientras que el 81 o el 14 % de las proteínas se encuentran N-glucosiladas en las tres muestras, casi la mitad de las proteínas (32 % en microfilarias, 12 % en mujeres y 3 % en hombres) solo están N-glucosiladas en una de las tres muestras. . La mayor superposición del 34% de todas las N-glucoproteínas se da entre las muestras de gusanos hembra y microfilarias. Es probable que esta superposición se confunda con las microfilarias intrauterinas que están presentes en los gusanos hembra y se debe tener en cuenta cuando se encuentran glucositos N específicos en común entre las microfilarias y las hembras en las glucoproteínas N individuales. De los tres tipos de muestras estudiados aquí, las microfilarias tienen la mayor cantidad de N-glucoproteínas con 477 y las N-glucoproteínas más exclusivas con 188. Esto podría deberse a que las microfilarias necesitan evadir el sistema inmunitario mientras migran de los vasos linfáticos a la circulación periférica y posteriormente desarrollarse aún más dentro de un mosquito vector. Los gusanos macho tienen la menor cantidad de N-glucoproteínas, así como la menor cantidad de N-glucositos (Tabla 1, Fig. 1a, c). No está claro qué es responsable de este nivel más bajo observado de N-glicosilación. Sin embargo, hay 17 N-glucoproteínas de gusano macho que no se encuentran N-glucosiladas en las muestras Total o Fbs1 de gusanos hembra adultos o microfilarias.

Al comparar las 582 proteínas glicosiladas unidas a N con los proteomas de B. malayi publicados anteriormente, encontramos que 111 proteínas (19 %) no se habían identificado previamente en ningún estudio proteómico (Fig. 4, No Match). Esto muestra el poder del enriquecimiento de Fbs1 para extraer el proteoma en busca de proteínas de baja abundancia o difíciles de encontrar. Nuestra identificación de proteínas N-glicosiladas también agrega contexto a los proteomas publicados anteriormente; agregamos el estado de glicosilación a 471 proteínas informadas anteriormente. Por ejemplo, 136 N-glicoproteínas se superpusieron con proteomas secretores excretores y 188 se superpusieron con un proteoma de membrana. Esta información puede ayudarnos a comprender dónde se encuentran estas N-glucoproteínas y en qué etapa están presentes en el gusano.

Análisis de datos UpSetR de N-glucoproteínas de B. malayi identificadas con proteomas de B. malayi publicados anteriormente: EV 201830 es el proteoma de vesícula extracelular. ES 200829 y ES 200928 son los conjuntos de proteomas excretores y secretores. Membrana. 201931 son los conjuntos de proteoma de superficie y membrana; BDR 201542 es la pared del cuerpo, el tracto digestivo y los conjuntos de proteoma del tracto reproductivo. SS 201143 es el conjunto de proteomas específicos de etapa. No Match indica glicoproteínas N identificadas que no se encuentran en estos seis estudios proteómicos. El tamaño del conjunto que se muestra a la izquierda indica el número de proteínas en cada conjunto. Las barras que están encima de los puntos individuales muestran el número de proteínas N-glucosiladas exclusivas de ese proteoma. Las barras que están encima de múltiples puntos unidos muestran el número de proteínas N-glicosiladas en común con esos proteomas50.

Para analizar los datos de enriquecimiento de genes y explorar la función y la información de localización, se obtuvo la anotación de datos de ontología de genes para las proteínas N-glicosiladas y se realizó un análisis de enriquecimiento de genes utilizando g: Profiler51 (Tabla complementaria S4, Fig. 5a). Si bien estuvo ausente para aproximadamente un tercio o 179 de las glicoproteínas unidas a N, 403 glicoproteínas unidas a N tenían alguna anotación de ontología génica o información de la vía KEGG45. Esto incluyó la anotación del componente celular para el 329 o el 57 % de las N-glucoproteínas donde el análisis de enriquecimiento muestra que las proteínas que están asociadas a la membrana, las proteínas extracelulares o de la superficie celular están sobrerrepresentadas; Anotación del proceso biológico para el 148 o el 25 % de las N-glucoproteínas y anotación de la función molecular para el 123 o el 21 % de las N-glucoproteínas donde las proteínas implicadas en la proteólisis, la glicosilación y la adhesión están sobrerrepresentadas. Del mismo modo, las vías KEGG45 importantes en la glicosilación y la degradación de proteínas también están sobrerrepresentadas. Como se esperaba para las proteínas N-glicosiladas, esto confirma que estas proteínas tienen las características esperadas en las proteínas que interactúan con el parásito del huésped.

Ontología de genes y predicción y análisis de localización subcelular (a): los gráficos de dispersión ilustran los términos GO enriquecidos y las vías de la base de datos KEGG. El eje vertical representa los términos enriquecidos en cada categoría y el eje horizontal representa el valor p de enriquecimiento. El valor de p se limitó a 16, como se indica en la línea discontinua vertical oscura. El tamaño de los puntos muestra el número de gen y el color muestra el tipo de muestra. El conjunto GO:BP son los principales términos ontológicos del gen del proceso biológico, el conjunto GO:CC son los principales términos ontológicos del gen del componente celular, GO:MF son los principales términos ontológicos del gen de la función molecular y el conjunto KEGG son las principales vías KEGG (b): El gráfico de barras proporcional indica el número de N-glucoproteínas en diez ubicaciones subcelulares diferentes; el naranja indica las proteínas de membrana predichas y el gris indica las proteínas solubles.

Además, utilizamos DeepLoc-1.0, que utiliza un algoritmo basado en secuencias para predecir la localización subcelular53. Esta anotación extendió las predicciones de localización subcelular a las 582 proteínas (Tabla complementaria S5). Se prevé que más del 50% de las proteínas sean proteínas de membrana y se dividen principalmente en membrana celular, retículo endoplásmico, aparato de Golgi y lisosoma/vacuola (Fig. 5b). De las 278 N-glicoproteínas restantes que se predijo que eran proteínas solubles, se predijo que aproximadamente la mitad serían proteínas extracelulares. La ontología génica, las predicciones de localización subcelular y la información de estudios proteómicos anteriores ayudan a medir las N-glucoproteínas para sus posibles interacciones con el parásito huésped.

Las dos proteínas de la cutícula mencionadas anteriormente, gp29, una probable glutatión peroxidasa y gp15/400, una proteína relacionada con alérgenos de poliproteínas de nematodos, están presentes en todas las muestras analizadas. El mapeo de glucositos de gp29 (Bm2151a) indica una N-glucosilación variable; en muestras de gusanos hembras donde esta proteína es abundante (40 péptidos únicos en la muestra Total y 36 péptidos únicos en la muestra Fbs1), ambos N-glucositos canónicos46 a 39 NQT y 92 NGT están glicosilados en las muestras Total y Fbs1, mientras que en los gusanos machos ( 8 péptidos únicos en la muestra Total y 4 péptidos únicos en la muestra Fbs1), los péptidos en las muestras Total y Fbs1 muestran que solo el sitio 39 está glicosilado y en microfilarias (4 péptidos únicos en la muestra Total y 2 péptidos únicos en la muestra Fbs1) los péptidos en la muestra de Fbs1 muestran que solo el sitio 92 está glicosilado. Dado que no se identifican péptidos aglicosilados que se superpongan en el sitio 92 en las muestras totales masculinas o el sitio 39 en las muestras totales de microfilarias, no podemos confirmar de manera concluyente la ausencia de glicosilación, pero esperaríamos que el enriquecimiento de Fbs1 hubiera enriquecido esos péptidos si hubieran sido N-glicosilados. Como se señaló anteriormente, no podemos diferenciar en las muestras femeninas si el N-glucosito está presente solo en el tejido femenino, en la microfilaria intrauterina o en ambos. Entonces, en este caso, el sitio 92 en la muestra femenina puede deberse a la microfilaria intrauterina. Con 58 péptidos únicos identificados en Total femenino, 26 péptidos únicos en Total masculino y 17 péptidos únicos en Total de microfilarias, gp15/400 (Bm6084) es una proteína de cutícula relativamente abundante. Se informa que se une a los lípidos y tiene 16 repeticiones múltiples en tándem de un dominio específico de nematodo ABA-122,23 que contiene un solo N-glucosito canónico dentro del dominio repetido. Nuestros datos muestran que este glucosito NLT se encuentra tanto aglucosilado como glicosilado en muestras femeninas y de microfilarias y glicosilado en muestras masculinas. Sin embargo, debido a las repeticiones en tándem, no podemos determinar cuántos de estos 16 N-glicositos repetidos están ocupados. Además, gp15/400 tiene otros 8 N-glucositos canónicos46 que no se encuentran en las repeticiones en tándem. Cuatro de estos sitios en 139 NDS, 359 NGS, 527 NVT y 2867 NHS están glicosilados en gusanos hembra, mientras que tres sitios en las posiciones 139, 359 y 527 están glicosilados en microfilarias y solo dos en 527 y 2867 están glicosilados en gusanos macho. Por el contrario, el ortólogo de C. elegans, npa-1, con un fenotipo de vida útil prolongada de ARNi61 tiene repeticiones en tándem pero no N-glicositos canónicos46, lo que abre la posibilidad de que la N-glicosilación de gp15/400 tenga un papel especializado en B. malayi.

También verificamos otras proteínas de la cutícula identificadas por Page et al. como objetivos potenciales de biosíntesis de cutícula y muda25 y destacan tres N-glicoproteínas de cutícula adicionales. En primer lugar, se ha demostrado que Bma-PHY-1 (Bm3843) es importante para el desarrollo de la cutícula mediante estudios de ARNi en B. malayi62. Es un ortólogo de C. elegans dpy-18, que es una subunidad α de prolil-4-hidroxilasa importante en la biosíntesis de colágeno63,64. También se ha demostrado que C. elegans dpy-18 está N-glicosilado aunque en un glicosito diferente21. Se encontraron péptidos para Bma-PHY-1 en muestras femeninas, masculinas y de microfilarias, pero de 2 posibles N-glucositos canónicos, solo se encontraron péptidos glicosilados para el glucosito en 157 NAS y solo en muestras femeninas y de microfilarias. En segundo lugar, Bm-MLT-7 (Bm7474) es un ortólogo de C. elegans mlt-7 que tiene un fenotipo de letalidad larvaria temprana de ARNi. Se predice que tiene actividad de unión al hemo y actividad de peroxidasa esencial importante para la síntesis de la cutícula y la muda65, y se muestra que está N-glicosilada en ambos N-glicositos canónicos presentes en la proteína21. En nuestros datos, se encontraron péptidos para Bm-MLT-7 en muestras femeninas, masculinas y de microfilarias, y aunque ambos N-glicositos canónicos a 95 NST y 477 NIS estaban N-glicosilados en muestras femeninas, solo 95 estaban N-glicosilados en microfilarias. . En tercer lugar, se predice que Bm-CPZ-1 (Bm3754) es una proteasa de cisteína basada en catepsina importante en la ecdisis, el desarrollo de la cutícula y la morfogénesis del cuerpo posembrionario con fenotipo de ARNi en B. malayi de liberación reducida de microfilarias66. Sus ortólogos, C. elegans cpz-1 y O. volvulus cpz-1, tienen fenotipos de ARNi que muestran defectos de muda67,68. Se ha demostrado que C. elegans cpz-1 está N-glicosilado en un sitio21. En nuestros datos, esta proteína se encontró en los tres conjuntos de datos y se encontraron péptidos N-glicosilados para el único N-glicosito canónico en 187 NYT en gusanos hembra y microfilarias. Aunque no hay confirmación de péptidos aglicosilados, la falta de N-glicosilación encontrada en muestras de Fbs1 macho para estas tres proteínas de la cutícula refuerza tanto el nivel de glicosilación más bajo observado en gusanos machos como la variabilidad en la N-glicosilación de proteínas entre gusanos machos y hembras. y microfilarias.

Estudios previos identificaron a ES-62, Bm-mif-1, Serpin y BmVal1 como proteínas importantes que modulan el sistema inmunológico del huésped28. ES-62 (Bm9816) es una leucil aminopeptidasa predicha con actividad inmunomoduladora del huésped que se ha relacionado con la fosforilcolina en sus N-glicanos27,28. Recientemente, se caracterizó el estado de N-glicosilación de A. viteae ES-62 de una muestra mixta de adultos y mostró tanto la heterogeneidad de los glicanos que contienen PC como las diferencias en la ocupación del sitio en los cuatro sitios de N-glicosilación de la proteína19. Si bien A. viteae ES-62 y Bm9816 son idénticos en un 71 % según BlastP39, sus N-glucositos no se superponen, lo que destaca que incluso con proteínas con un alto nivel de identidad, los N-glucositos también pueden diferir. En nuestros datos, Bm9816 se encuentra en los tres conjuntos de datos, pero aunque es relativamente abundante en la muestra femenina (20 péptidos únicos en la muestra total) y en la muestra de microfilarias (17 péptidos únicos en la muestra total), solo se identificó un péptido único en la muestra. muestra masculina. Se encontraron péptidos N-glicosilados para 4 N-glicositos a 30 NDT, 128 NIT, 146 NVS, 241 NHT para ES-62 en las muestras femeninas y de microfilarias de los 6 N-glicositos canónicos posibles presentes en la proteína. El N-glicosito a 241 NHT es uno de los pocos casos en los que un N-glicosito estaba presente tanto en las muestras de hembra Total como en las de microfilaria Total y no en ninguna de las muestras de Fbs1. No se identificaron péptidos glicosilados en la muestra masculina. Bm-mif-1 (Bm6870) es un factor inhibidor de la migración de macrófagos secretados por filarias y se descubrió que es un antígeno principal de la infección por gusanos parásitos24,69. Esta proteína es relativamente abundante en muestras Total (19, 8, 22 péptidos únicos en hembra, macho y microfilaria, respectivamente) pero no se encontró en muestras enriquecidas con Fbs1, lo que indica que al menos en gusanos adultos y microfilarias, Bm-mif-1 no es N-glicosilada a pesar de que tiene dos N-glicositos canónicos. Puede ser que esté N-glicosilado en una etapa de vida diferente o en condiciones no estudiadas aquí. Serpin (Bm9380) es un inhibidor de la serina proteasa microfilarial que se cree que actúa sobre las enzimas de los neutrófilos humanos70. Como era de esperar, los péptidos de Serpin no se encontraron en los conjuntos de datos femeninos o masculinos, pero estaban presentes en muestras enriquecidas con microfilarial Total y Fbs1 con N-glucosilación identificada en ambos N-glucositos canónicos, 21 NST y 266 NSS. Se ha demostrado que BmVal1 (Bm4233b) es una proteína importante en las interacciones del parásito huésped con una respuesta alta de anticuerpos del huésped71. Además, en un estudio reciente de transcriptómica espacial de B. malayi, BmVal1 se identificó entre los transcritos de genes enriquecidos en la cabeza femenina importantes para los comportamientos de alimentación, sensoriales, secretores y reproductivos y, por lo tanto, es un objetivo farmacológico prometedor para gusanos adultos72. La glicoproteína BmVal1 tiene 2 N-glucositos canónicos y se ha producido de forma recombinante en células vegetales con ambos sitios glicosilados y se ha determinado su estructura proteica71. En nuestro estudio, ambos N-glicositos a 52 NGT y 138 NLT estaban glicosilados en las muestras femeninas y de microfilarias, mientras que en las muestras masculinas solo había datos para confirmar que el segundo sitio en 138 está glicosilado.

Bm5654 es un ortólogo de una aminopeptidasa (antígeno H11) que ha demostrado ser una parte importante de un extracto inmunoprotector en H. contortus73,74. Esta protección se ha relacionado con la N-glicosilación74. Bm5654 se encuentra en los tres conjuntos de datos y es abundante en la muestra femenina (43 péptidos únicos en la muestra total) y en la muestra masculina (12 péptidos únicos en la muestra total), pero solo se identificó un péptido único en la muestra total de microfilarias. Se encontraron péptidos N-glucosilados para 8 N-glucositos en las muestras femeninas de un posible 15 N-glucositos canónicos presentes en la proteína a 83 NVS, 115 NLT, 133 NMT, 265 NET, 419 NQT, 440 NIS, 789 NLT, y 970 NDS. Solo se identificó un N-glucosito en 970 en muestras masculinas. Aunque menos abundante en la muestra de microfilarias, el enriquecimiento de Fbs1 mostró que esta proteína estaba N-glicosilada en 6 N-glicositos, incluido uno a 241 NIT que no se encuentra en muestras femeninas. La alineación de Bm5654 con su ortólogo de H. contortus (41 % de identidad) usando BlastP39 muestra que solo se comparte el último de los 8 N-glucositos identificados en 970 y es NSS en el antígeno H11 de H. contortus.

Para examinar las proteínas de parásitos adultos y evitar las proteínas que pueden aparecer en las muestras femeninas debido a las microfilarias intrauterinas, nos centramos en las 15 N-glucoproteínas que están N-glucosiladas tanto en los gusanos hembra como en los machos, pero que no tienen péptidos identificados en las muestras microfilarial Total o Fbs1. (Fig. 2b, Tabla 2). Debido a que estas muestras eran lisados ​​de gusanos completos, no es posible distinguir la ocupación parcial de un N-glicosito como una N-glicosilación específica de tejido o la presencia de dos proteínas glicosiladas diferencialmente en el mismo tejido.

Bm14109 es un ejemplo de una proteína relativamente abundante (98 péptidos únicos en Total femenino y 47 péptidos únicos en Total masculino) con patrones variables de N-glicosilación que se encuentran en gusanos machos y hembras adultos, pero no se encuentran en microfilarias. Esta proteína es una proteína transportadora de lípidos basada en ontología génica. En estudios proteómicos anteriores, se encontró en vesículas extracelulares de hembras adultas 30, muestras de superficie de gusanos adultos 31 y muestras de membrana 31, lo que significa una posible interacción con el parásito del huésped. Esto se ve reforzado por un reciente estudio de transcriptómica espacial, donde se enriquece en la cabeza, una interfaz huésped-parásito susceptible de medicación, así como en el intestino, donde están presentes candidatos a fármacos y vacunas de "antígenos ocultos" restringidos al tubo digestivo72. En nuestro estudio, ocho de los 12 glucositos unidos a N canónicos se identificaron en gusanos adultos femeninos en los sitios 131 NNT, 548 NET, 634 NFT, 1187 NRT, 1524 NAT, 1638 NLT, 1692 NLS y 1840 NES con el sitio en la posición 1840 también encontró aglicosilados en muestras Totales femeninas y masculinas. Exhibiendo variabilidad en la N-glicosilación entre gusanos hembra y macho, solo se encontró una N-glicosita en la posición 1897 NKT glicosilada en muestras macho. Los únicos ortólogos de Bm14109 identificados por la proteína Blast39 del NCBI se encuentran en el suborden de nematodos Spirurina75 o dentro del Clade III de nematodos parásitos34. La Tabla 3 muestra la taxonomía de Brugia malayi como se enumera en NCBI75. La aparición de esta proteína en la interfase del parásito huésped y en un suborden de nematodos principalmente parásitos indica que esta glicoproteína podría tener un papel altamente especializado.

Bm10521, Bm10329 y Bm10905 son glicoproteínas adicionales con ortólogos restringidos al suborden de nematodos Spirurina. Estas glicoproteínas no se encuentran en nuestras muestras de microfilarias, pero están presentes en gusanos machos y hembras adultos. Además, los datos transcriptómicos muestran que las transcripciones de Bm10521 están restringidas a gusanos adultos y las transcripciones de Bm10329 y Bm10905 son más frecuentes en gusanos adultos76,77. Se prevé que la proteína Bm10521 esté en la membrana, pero por lo demás no está caracterizada. Nuestros datos muestran que en los gusanos macho está glicosilado en dos de los ocho N-glicositos canónicos en 479 NSS y 806 NDT, mientras que en los gusanos hembra solo está glicosilado en un único N-glicosito diferente en 749 NDS. DeepLoc53 predice que Bm10329 es una proteína extracelular. En estudios previos de proteómica, se identificó en muestras enriquecidas en membrana31 y en el estudio de transcriptómica espacial se encontró que estaba enriquecido en el intestino72. El único sitio canónico está N-glicosilado a 253 NVT tanto en gusanos hembra como macho. Este sitio también se encuentra aglicosilado en gusanos hembra. Por último, Bm10905 está restringido no solo al suborden Spirurina sino también a la familia Onchocercidae. Se prevé que sea extracelular por DeepLoc53 y por lo demás no caracterizado. Nuestros datos muestran que de los 3 N-glucositos canónicos posibles, está N-glucosilado en 2 sitios en gusanos hembra a 37 NTS y ​​93 NET y solo en el sitio 37 en gusanos macho. Si bien la falta de homología con las proteínas caracterizadas dificulta la asignación de cualquier función a Bm14109, Bm10521, Bm10329 y Bm10905, ese estado indeterminado junto con sus datos de ubicación celular previstos y observados hace que estas N-glucoproteínas sean candidatas atractivas para un estudio adicional.

Los ejemplos restringidos por nematodos de N-glicoproteínas en la Tabla 2 son Bm3266 y Bm8085. Se predice que Bm3266 por ontología génica se une a lípidos y por DeepLoc53 se predice que es una proteína extracelular. El ARNi de su ortólogo de C. elegans, F10D11.6, mostró fenotipos letales embrionarios y letales larvarios78. Aunque Bm3266 tiene 5 N-glicositos canónicos, está N-glicosilada tanto a 817 NTT como a 884 NAS en gusanos hembra y solo a 884 en gusanos macho. También se predice que Bm8085 es una proteína extracelular y tiene un dominio familiar similar a la transtiretina (TTR). Recientemente, las proteínas con este dominio TTR se han descrito como los principales antígenos de las infecciones por filarias humanas24. Aunque su ortólogo en C. elegans no tiene un fenotipo de ARNi, probablemente debido a la redundancia, se ha demostrado que es importante en las interacciones de célula a célula. Específicamente para C. elegans ttr-52, actúa como una molécula puente que media la apoptosis79. Bm8085 está N-glicosilado en su único N-glicosito canónico 29 NGT en gusanos hembra y macho. Debido a que no tienen ortólogos cercanos en el genoma del huésped, tanto Bm3266 como Bm8085 pueden ser candidatos interesantes para estudios posteriores.

Bm3610 solo se encuentra en gusanos macho y hembra con cinco de ocho N-glicositos canónicos identificados en gusanos hembra en 131 NIS, 227 NMT, 272 NGS, 394 NRT y 477 NIS y 3 N-glicositos identificados en gusanos macho en 131, 227 y 477. Es una proteína transmembrana de un solo paso que se predice que está en el aparato de Golgi por ontología génica, mientras que DeepLoc53 predice que es una proteína/enzima del RE. La función molecular de la ontología génica predice que es parte de la familia de glicosiltransferasa 14. Se trata de una familia bien conservada pero diversa de enzimas beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa que pueden convertir N-acetillactoseaminoglicanos lineales en ramificados o formar ramificaciones de cadena lateral cruciales en O-glicanos. Los estudios proteómicos previos no concuerdan con la ubicación prevista para esta enzima y han encontrado Bm3610 en el proteoma ES29, el proteoma de la pared corporal42, el proteoma de superficie y el proteoma de membrana31. Los ortólogos de C. elegans, F30A10.4, R07B7.6 y F35H8.2, son otras glicosiltransferasas, esta última anotada como una proteína de la membrana de Golgi y N-glucosilada en tres N-glucositos21. En particular, los N-glicositos para estos y otros ortólogos de C. elegans identificados por BlastP39 no se superponen con los sitios de N-glicosilación de Bm3610 y la identidad proteica entre estos ortólogos de nematodos está por debajo del 40 %. Cuando buscamos ortólogos humanos que usan BlastP39, encontramos enzimas como C2GnT380, una enzima de ramificación de O-glicano de tipo mucina con un 30 % de identidad proteica. Y al igual que con los ortólogos de C. elegans, no hay superposición con los sitios de N-glicosilación de C2GnT3. Esto apunta a la posibilidad de que, aunque pertenece a la misma familia de glicosiltransferasas, Bm3610 puede desempeñar un papel diferente o ser activo en un sustrato diferente, especialmente si esta enzima está presente en la superficie, como lo indican los estudios de proteómica.

Los nematodos son un grupo amplio y diverso de organismos que se han organizado en cinco clados. Tanto C. elegans como H. contortus pertenecen a los nematodos del Clado V, mientras que B. malayi y otros nematodos filariales pertenecen a un grupo distinto de nematodos del Clado III34. Ampliamos nuestros hallazgos utilizando los N-glucoproteomas de C. elegans y H. contortus para buscar N-glucoproteínas en común y N-glucoproteínas exclusivas de B. malayi. Primero buscamos ortólogos de las N-glucoproteínas de B. malayi identificadas en estos dos proteomas de nematodos54. Identificamos ortólogos para 425 de 582 N-glicoproteínas de B. malayi dejando 157 N-glicoproteínas filariales o específicas de B. malayi que no tienen un ortólogo identificado en C. elegans o H. contortus (Tabla complementaria S6C. elegans y H. contortus orthologs, Fig. 6). Como era de esperar, como C. elegans y H. contortus son nematodos del Clado V y están estrechamente relacionados entre sí, 361 N-glucoproteínas de B. malayi tenían ortólogos en ambas especies (Fig. 6: recuadro en gris). Solo 31 ortólogos de N-glucoproteínas de B. malayi eran exclusivos de C. elegans (Fig. 6: barras 2 y 4) y 33 únicos de H. contortus (Fig. 6: barras 3 y 5). Luego verificamos si los ortólogos de C. elegans o H. contortus estaban presentes en sus respectivos N-glucoproteomas21,32,35. Mientras que 31 N-glucoproteínas de B. malayi tienen ortólogos de C. elegans y H. contortus que también se han identificado como N-glucoproteínas, 119 N-glucoproteínas de B. malayi tienen ortólogos de C. elegans que también son N-glucoproteínas y 71 B. Las N-glucoproteínas malayi tienen ortólogos de H. contortus que también son N-glucoproteínas. Este conjunto compartido de N-glucoproteínas entre B. malayi, C. elegans y H. contortus se puede explorar más a fondo para identificar proteínas importantes que son exclusivas del ciclo de vida del nematodo y que son únicas o diferentes del huésped mamífero. Esperamos que algunas de estas N-glucoproteínas ortólogas tengan N-glucositos que estén alineados o conservados y que otros difieran de los encontrados para los antígenos ES-62 y H11 mencionados anteriormente. Exploramos esto más a fondo mediante el uso de una alineación múltiple55 de una N-glucoproteína bien conservada, la integrina beta, que está presente en los tres N-glucoproteomas de nematodos (Figura complementaria S2). La integrina beta Bm7611 tiene siete N-glicositos identificados de los ocho N-glicositos canónicos posibles en 54 NYT, 276 NNS, 407 NAS, 537 NES, 679 NET, 700 NDT y 728 NLT con tres sitios glicosilados en las tres muestras, un sitio exclusivo para muestras masculinas y 2 sitios exclusivos para muestras de microfilarias. En el ortólogo de integrina beta de C. elegans (72 % de identidad), se identificaron ocho N-glicositos que incluían cinco N-glicositos alineados en 54, 276, 407, 537, 679 y 700, así como un N-glicosito diferente en 143 NVT que no es un N-glucosito canónico en B. malayi pero se comparte en la secuencia de H. contortus. Un segundo sitio identificado es exclusivo de C. elegans en 400 NAS y no está presente en los otros dos ortólogos. El ortólogo de integrina beta de H. contortus (72 % de identidad) tiene dos N-glicositos identificados en 407 y 537. No tiene N-glicositos canónicos que se alineen con 276 o 679, pero sí se alinean con los restantes N-glicositos identificados de B. malayi lo que podría sugerir que estos sitios están N-glicosilados en otras etapas del ciclo de vida del nematodo H. contortus. Por lo tanto, las diferencias observadas en los N-glicositos alineados o conservados resaltan la posibilidad de una variación en la ocupación de N-glicositos basada en la expresión del tejido o en las etapas de la vida. Además, las 157 N-glicoproteínas sin ortólogos son un conjunto prometedor de proteínas para explorar, ya que posiblemente sean N-glicoproteínas filariales o específicas de B. malayi.

Análisis de datos UpSetR de ortólogos de B. malayi N-glicoproteínas en C. elegans y H.contortus: HCON_N-glicoproteína indica todos los ortólogos de H. contortus que se han identificado como N-glicoproteínas. HCON_ortholog indica los ortólogos restantes de H. contortus que no se identificaron como N-glucoproteínas. CELE_N-glicoproteína indica todos los ortólogos de C. elegans que se han identificado como N-glicoproteínas. CELE_ortholog indica los ortólogos de C. elegans restantes que no se identificaron como N-glucoproteínas. Ningún ortólogo indica que no hubo ortólogos identificados ni en C. elegans ni en H. contortus. El tamaño del conjunto que se muestra a la izquierda indica el número de proteínas en cada conjunto. Las barras que están encima de los puntos individuales muestran el número de proteínas N-glicosiladas exclusivas de ese conjunto de proteínas. Las barras que están encima de múltiples puntos unidos muestran el número de proteínas N-glicosiladas en común con ese conjunto de proteínas. El recuadro gris muestra las N-glucoproteínas de B. malayi que tenían ortólogos en ambas especies.

Junto con otros N-glucoproteomas de nematodos y N-glucoproteínas individuales de B. malayi, este mapeo de 1273 N-glucositos de B. malayi en 582 N-glucoproteínas de gusanos macho adultos, gusanos hembra adultos y microfilarias se suma a los datos proteómicos y a nuestra comprensión actual de la N-glicosilación de este parásito filarial. El mapeo de N-glucositos a partir del enriquecimiento de N-glucopéptidos con Fbs1 arrojó conjuntos de datos altamente enriquecidos al aumentar tanto el número como la proporción de N-glucositos identificados al tiempo que disminuyó el fondo de los péptidos N + 3 sin motivos canónicos de N-glucositos. La predicción de la ontología génica y la localización celular mostró que el N-glicoproteoma estaba enriquecido en proteínas de membrana y extracelulares. Mostramos que este conjunto de N-glicoproteínas se puede extraer de diferentes maneras. La caracterización de la ocupación de N-glicosito de proteínas individuales como se indica para las proteínas altamente glicosiladas enumeradas en la Tabla 1 y representada para Bm7191 en la Fig. 3 mostró variaciones que podrían señalar diferencias biológicas y deben explorarse más a fondo para determinar su importancia. De manera similar, la exploración de la N-glicosilación de la cutícula y las proteínas inmunomoduladoras previamente identificadas en estas tres etapas del huésped confirmó la variación en la ocupación de N-glicosito presente en estas proteínas biológicamente importantes. La investigación de grupos de proteínas como el conjunto restringido de gusanos adultos y cómo se relacionan con la biología del parásito condujo a la identificación de N-glucoproteínas específicas de parásitos y nematodos en la interfaz del huésped. Las N-glucoproteínas identificadas sin ortólogos del huésped son candidatos terapéuticos o biomarcadores prometedores. Como continuación de este trabajo, planeamos caracterizar los péptidos enriquecidos con Fbs1 sin escisión de PNGasa F para estudiar los N-glucopéptidos intactos y correlacionar las estructuras de glucano con glucositos específicos81. Además de confirmar nuestro estudio de ocupación y mapeo de N-glicositos, la caracterización de las estructuras de N-glicanos y su heterogeneidad en cada sitio para gusanos macho, gusanos hembra y microfilarias proporcionará una comprensión integral de la N-glicosilación de las proteínas del parásito filarial.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE38 con el identificador de conjunto de datos PXD039002 y 10.6019/PXD039002.

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Agradecemos a Clotilde S. Carlow, Thomas C. Evans Jr., Lindsey J. Cantin, Laudine MC Petralia y Douglas M. Oswald por sus comentarios críticos y la revisión del manuscrito. Agradecemos al Sr. James Ellard y al Dr. Salvatore V. Russello por su continuo apoyo a la investigación de la glicobiología de parásitos.

FM, CM, CR, MC y JF recibieron fondos y fueron empleados de New England Biolabs en el momento en que se realizó el trabajo. CR ahora es un empleado de Moderna. Estas afiliaciones no alteran nuestra adhesión a todas las políticas de Scientific Reports sobre el intercambio de datos y materiales.

Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, Ipswich, MA, 01938, EE. UU.

Fana B. Mersha, Colleen M. McClung, Minyong Chen, Cristian I. Ruse y Jeremy M. Foster

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JF concibió los experimentos y supervisó el proyecto, FM diseñó y realizó los experimentos con el apoyo de MC en enriquecimiento Fbs1 y CM y CR en espectrometría de masas. FM analizó los resultados, produjo gráficos y escribió el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión, edición y aprobación del manuscrito final.

Correspondencia a Fana B. Mersha o Jeremy M. Foster.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mersha, FB, McClung, CM, Chen, M. et al. Definición del N-glucoproteoma filarial mediante mapeo de glucositos en el nematodo parásito humano Brugia malayi. Informe científico 13, 7951 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

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Recibido: 08 febrero 2023

Aceptado: 10 de mayo de 2023

Publicado: 16 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

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