prostaglandina

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1169 (2022) Citar este artículo

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Los análogos de prostaglandina son tratamientos de primera línea para el glaucoma de ángulo abierto y, si bien son efectivos para reducir la presión intraocular, se ven socavados por el incumplimiento del paciente, lo que provoca atrofia del nervio óptico y discapacidad visual grave. En este documento, evaluamos la seguridad y la eficacia de una terapia génica mediada por un vector viral recombinante adenoasociado destinada a reducir permanentemente la presión intraocular a través de la biosíntesis de novo de prostaglandina F2α dentro de la cámara anterior. Este estudio demostró una reducción dependiente de la dosis en la presión intraocular en ratas Brown Norway normotensas mantenidas durante 12 meses. Fundamentalmente, la terapia podría detenerse temporalmente mediante la activación de riboswitch fuera de tipo, revirtiendo la presión intraocular a la normalidad. Las imágenes multimodales longitudinales, la electrofisiología y la histología post-mortem revelaron que la terapia fue bien tolerada en dosis bajas y medias, sin efectos adversos importantes para la salud de la cámara anterior, lo que ofrece una alternativa prometedora a las estrategias de tratamiento actuales que conducen a reducciones clínicamente relevantes en la presión intraocular sin la necesidad de adherirse a un régimen de tratamiento diario.

El glaucoma de ángulo abierto (OAG, por sus siglas en inglés) es un trastorno ocular complejo que afecta aproximadamente a 79,6 millones de personas en todo el mundo y provoca la pérdida progresiva de las células ganglionares de la retina, daño axonal dentro del nervio óptico y, en última instancia, ceguera1. Si bien el glaucoma de ángulo abierto tiene múltiples factores de riesgo ambientales y genéticos, la fisiopatología subyacente a la elevación de la PIO se centra en el desequilibrio entre la producción de humor acuoso por el cuerpo ciliar y el drenaje acuoso a través de la malla trabecular2. Como consecuencia, las estrategias de tratamiento actuales, tanto farmacológicas como quirúrgicas, se centran en lograr una reducción de la PIO mediante la inhibición de la producción acuosa o el aumento del drenaje acuoso, con el objetivo de disminuir la presión mecánica sobre la retina y el nervio óptico para preservar la visión3, 4,5.

Los agentes farmacológicos se administran como tratamientos de primera línea y se dividen en cinco clases principales: inhibidores de la anhidrasa carbónica, agonistas adrenérgicos, inhibidores de la quinasa RHO, bloqueadores beta y análogos de la prostaglandina F2α (PGF2α), siendo estos últimos los más utilizados6,7,8. Los análogos de PGF2α, como Latanoprost, Bimatoprost y Travoprost, se aplican tópicamente como profármacos en la superficie corneal a través de gotas para los ojos, donde se absorben a través del epitelio corneal y se hidrolizan en conformaciones activas a medida que atraviesan el estroma, antes de liberarse en el humor acuoso. Después de la liberación en el humor acuoso, los análogos de PGF2α aumentan el drenaje a través de la vía de salida uveoescleral tras la remodelación de la matriz extracelular que rodea el músculo ciliar6,9,10,11,12,13. Si bien el uso de agentes tópicos puede ser eficaz y conducir a una reducción de la PIO de aproximadamente un 25 %, su uso está asociado con numerosos efectos secundarios, que incluyen irritación de la superficie ocular, visión borrosa, decoloración del iris (hiperpigmentación), enrojecimiento (hiperemia), crecimiento excesivo o engrosamiento de las pestañas (hipertricosis), profundización de los párpados (orbitopatía), hipersensibilidad a la luz y recurrencia de infecciones concurrentes (p. ej., queratitis herpética)14,15,16,17,18. Como resultado de la mala tolerabilidad de los tratamientos farmacológicos actuales para la GAA, junto con las dificultades asociadas con la aplicación correcta de gotas para los ojos y la falta de comentarios negativos inmediatos cuando se olvidan las dosis, los pacientes a menudo tienen dificultades para cumplir con los regímenes de tratamiento diarios. De hecho, los estudios en los que se controló electrónicamente el uso de gotas para los ojos por parte de los pacientes demostraron un cumplimiento extremadamente bajo de los tratamientos farmacológicos existentes, con un 44 % de los pacientes usando sus gotas para los ojos menos del 75 % del tiempo19,20.

En consecuencia, en los últimos años ha habido un impulso para desarrollar tratamientos farmacológicos de acción más prolongada con un enfoque en los implantes de fármacos de liberación sostenida, que se han estudiado tanto en ensayos clínicos en animales grandes como en humanos21,22,23,24,25,26. Se ha demostrado que los implantes, como el bimatoprost de liberación sostenida, provocan una reducción de la PIO hasta por 24 meses; sin embargo, solo el 28 % de los participantes mantuvo una PIO controlada durante ese período y otro 26,5 % de los pacientes necesitó colirios de rescate o la readministración de los implantes después de la degradación23. Además de lograr una reducción sostenida de la PIO en la mayoría de los pacientes, otro beneficio notable de dichos implantes es que la incidencia de ciertos efectos secundarios se redujo en relación con los pacientes que recibieron gotas oftálmicas tópicas, aunque los pacientes que recibieron bimatoprost de liberación sostenida mostraron hiperemia conjuntival. , edema macular e inflamación intraocular27. Si bien los implantes han demostrado ser relativamente seguros, hay pacientes que desarrollan pérdida de células endoteliales de la córnea como resultado del reemplazo del implante y, como tal, la Administración Federal de Medicamentos (FDA) ha limitado hasta ahora a los pacientes a un implante de 10 µg por ojo sin remisión. administración permitida27.

A pesar de que la etiología genética subyacente al desarrollo de GAA no se conoce por completo en la mayoría de los pacientes, la terapia génica sigue siendo una estrategia terapéutica atractiva que puede permitir la corrección del fenotipo de la enfermedad durante toda la vida después de una sola intervención28,29,30. Debido a las propiedades únicas del ojo, las indicaciones oftálmicas han estado a la vanguardia del campo de la terapia génica durante las últimas décadas y generalmente se han centrado en el uso de vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV), que se han demostrado en numerosos estudios preclínicos y clínicos para mediar la expresión transgénica segura y persistente en una variedad de tipos de células oculares y en una variedad de especies31,32,33,34,35. Si bien la mayoría de los estudios se centraron en el tratamiento de trastornos retinianos monogénicos hereditarios raros, como la amaurosis congénita de Leber, la coroideremia y la acromatopsia, la terapia génica también se puede usar para tratar enfermedades con etiología compleja, como la GAA, siempre que la fisiopatología subyacente es bien entendido36,37,38,39,40,41,42. Dado que décadas de práctica clínica han demostrado una clara correlación entre la reducción de la PIO y los resultados visuales positivos en pacientes con GAA, proponemos que la hipertensión ocular representa un factor de riesgo claro y modificable que podría modularse mediante un enfoque de terapia génica para preservar la visión en pacientes con GAA. pacientes Específicamente, dado que los análogos de prostaglandina son un estándar de oro para el tratamiento de OAG y son altamente efectivos para reducir la PIO cuando no se ven socavados por el cumplimiento deficiente del paciente, nuestro objetivo fue desarrollar un tratamiento de terapia génica para impulsar la biosíntesis de PGF2α directamente dentro del ojo a través de over-mediated rAAV. expresión de prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 (COX2), la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de PGF2α, desde el interior de las células de la cámara anterior43. Nuestra hipótesis es que el desarrollo de una terapia génica mediada por rAAV para sintetizar y liberar PGF2α nativa puede ser suficiente para reducir la PIO de manera segura y sostenida, lo que lleva a mejores resultados visuales a través de la eliminación del incumplimiento del paciente y al mismo tiempo reduce la incidencia y la gravedad. de los efectos secundarios observados cuando los análogos de prostaglandinas se administran por vía tópica.

En este documento, utilizamos ratas Brown Norway (BN) normotensas para evaluar la seguridad y la eficacia de nuestro tratamiento de terapia génica rAAV que expresa PGF2α destinado a reducir la PIO en pacientes que padecen hipertensión ocular después de una dosis terapéutica única. Usando una combinación de imágenes multimodales, electrofisiología, tonometría e histología post-mortem, demostramos una clara relación dependiente de la dosis entre los genomas del vector administrados y la PIO. Significativamente, logramos una reducción clínicamente relevante de la hipertensión ocular durante un período de 12 meses con una dosis bien tolerada. Excepcionalmente, a través de la inclusión de elementos riboswitch sensibles a la tetraciclina dentro del casete de expresión, demostramos que la expresión transgénica se puede "apagar" de manera temporal, pero efectiva, mediante la administración de un fármaco oral, lo que lleva a una reversión hacia la normotensión. Esta terapia representaría un cambio de paradigma en el manejo clínico de la OAG, lo que permitiría mejores resultados visuales al eliminar los problemas de cumplimiento del paciente y aumentar la calidad de vida del paciente a través de la reducción de la carga médica, los costos y la reducción de los efectos secundarios.

Para facilitar la producción de novo de PGF2α a partir de células de la cámara anterior, primero clonamos un casete de expresión que codifica la COX2 humana con codones optimizados, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de PGF2α, además del receptor de prostaglandina F humana (PTGFR) separados por un sitio de escisión de P2A e impulsado por un promotor de actina beta de pollo pequeño (CBA) que se expresa de forma ubicua. Se eligió la inclusión de PTGFR dentro de la construcción de expresión para construir un "circuito biológico" en el que tanto la molécula efectora (PGF2α) como su propio receptor están presentes en niveles altos dentro del tejido objetivo, una estrategia que se ha demostrado previamente en gatos para conducen a una mayor reducción de la PIO que la expresión de COX2 sola44.

El casete de expresión está flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR) derivadas de AAV2 para permitir el empaquetamiento en un vector rAAV recombinante, y también contiene dos elementos riboswitch sensibles a tetraciclina 'fuera de tipo' (TC40 y TC45), que hemos demostrado previamente permiten para la regulación a la baja postranscripcional de la expresión transgénica de un vector rAAV inyectado en el ojo tras la dosificación oral del ligando activador (es decir, tetraciclina)45,46. Si bien los ribointerruptores TC40 y TC45 no se han expresado en las células de la cámara anterior, se sabe que la tetraciclina se acumula dentro de la córnea y el humor acuoso después de la dosificación oral y, como tal, se espera que esté biodisponible para los elementos del ribointerruptor para impulsar la modulación génica47. La inclusión de un interruptor de apagado en el casete de expresión es una consideración crítica para el desarrollo de cualquier tratamiento de terapia génica para reducir la PIO basado en prostaglandinas, donde el manejo clínico de la GAA puede requerir la interrupción temporal del tratamiento con PGF2α en el caso de que un paciente desarrolle una enfermedad concurrente. infección, como la queratitis herpética18,48,49.

La actividad biológica de la construcción CBA.COX2.P2A.PTGFR.TC40/TC45 resultante (denominada en este documento CCPP) (Fig. 1a) se validó inicialmente in vitro mediante la transfección de células HEK293T, lo que resultó en un aumento significativo (prueba T no pareada, p = 0,0056, N = 2 (transfectado simuladamente), N = 3 (transfectado con CCPP)) niveles de PGF2α que se secretan en los medios de cultivo en comparación con los controles transfectados simuladamente (Fig. 1b). Habiendo establecido que el casete de expresión CCPP cataliza una producción significativamente mayor de PGF2α, la construcción se empaquetó posteriormente en rAAV2/2[MAX], un vector mutante de la cápside derivado de rAAV2 que contiene múltiples mutaciones puntuales (Quad YF + TV: Y272F, Y444F, Y500F , Y730F y T491V) y una inserción peptídica (7m8: R588_Q589insLALGETTRPA) conocida por aumentar la eficiencia de transducción y la penetración tisular en varios tipos de células oculares50,51,52. Cuando se inyecta en la cámara anterior de ratas BN, este vector de serotipo mutante de la cápside transduce células del endotelio corneal periférico, el iris y el ángulo iridocorneal (Fig. 1c, d).

Una representación esquemática del transgén CCPP impulsado por un potenciador de CMV y un promotor de smCBA que contiene dos ribointerruptores fuera de tipo de tetraciclina (TC40 y TC45), así como COX2 y PTGFR optimizados por codones humanos separados por una señal de escisión de P2A (a). Un ELISA de PGF2ɑ confirmó concentraciones significativamente más altas de PGF2ɑ en medios de cultivo celular después de la transfección con el transgén CCPP que los medios recolectados de células transfectadas simuladas (b) (prueba T no pareada, p = 0.0056, N = 2 (transfectadas simuladamente) N = 3 (CCPP transfectado), barras de error = SD). Las imágenes de campo claro y fluorescentes de los ojos rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry 8 semanas después de la inyección confirman el tropismo del vector dentro del iris, el endotelio corneal y el cuerpo ciliar (c, d). Barra de escala = 150 µm, Ampliación = 20×.

Ratas BN juveniles (6 a 8 semanas postnatales) (N = 30: 15 machos y 15 hembras) importadas de un criador comercial se sometieron a exámenes oftalmológicos completos para excluir la presencia de anomalías del desarrollo o de otro tipo en la estructura o función de la retina o la córnea. Es importante destacar que todos los animales mostraron una presión intraocular estable (PIO; 19,52 ± 3,23 mmHg, 1 SD, N = 30 ojos) antes de recibir inyecciones intraoculares de rAAV2/2[MAX].CCPP. Las ratas BN se asignaron aleatoriamente a una de las tres cohortes experimentales y recibieron una inyección intracameral unilateral de igual volumen (10 μl) que contenía una dosis baja (3,9 × 109 vg/ojo), media (3,9 × 1010 vg/ojo) o alta (3,9 × 1011 vg/ojo) dosis del vector rAAV2/2[MAX].CCPP purificado. El ojo contralateral en todos los animales permaneció sin inyectar para servir como control intra-animal y para limitar cualquier reflujo del vector que pudiera ocurrir durante el cambio de posición del animal.

A los 1, 2, 6, 9 y 12 meses después de la inyección, los examinadores que estaban enmascarados con respecto al grupo de tratamiento repitieron la tonometría de rebote en ratas BN conscientes para permitir que se detectaran las alteraciones en la PIO en respuesta a la terapia. medida objetivamente. Las ratas BN de dosis baja exhibieron reducciones no significativas (NS) en la PIO en todos los puntos durante el transcurso del tiempo en comparación con las mediciones de referencia (Fig. 2a; prueba de comparación múltiple de Dunnett, p ≥ 0,05 en todas las comparaciones, N = 11) y no se observó una tendencia significativa. observado durante todo el período de evaluación de 12 meses (Fig. 2b; regresión lineal simple, p = 0,1549).

Se encontró una reducción dependiente de la dosis en la PIO entre los grupos: los animales que recibieron dosis baja, media y alta mostraron una reducción del 12,6 %, 21,87 % y 43,2 % a los 12 meses respectivamente (a, c y e) que se mantuvo durante 12 meses (b; regresión lineal simple, p = 0,1549, N = 11 d; p = 0,0036, N = 9 y f; p < 0,0001, N = 10, Barras de error = SD). A los 12 meses, a los animales se les administró una dieta de tetraciclina al 5 % p/p y la PIO aumentó un 21,5 % y un 22,5 % en animales con dosis media y alta respectivamente después de 1 mes (c y e).

Las ratas de dosis media exhibieron una reducción significativa en la PIO a los 6 meses (Fig. 2c; prueba de comparación múltiple de Dunnett, p = 0.01, N = 9) y se observó una tendencia significativa de disminución de la PIO durante el período de 12 meses (Fig. 2d ; regresión lineal simple, p = 0,0036) con una reducción de la PIO del 21,88 % desde el inicio hasta los 12 meses.

Las ratas tratadas con dosis altas mostraron una reducción significativa de la PIO inicial a los 6, 9 y 12 meses (Fig. 2e; prueba de comparación múltiple de Dunnett, p ≤ 0,0021, N = 10) con una tendencia muy significativa de reducción de la PIO durante el período de 12 meses (Fig. 2f, regresión lineal simple, p < 0,0001). Las ratas tratadas con dosis altas exhibieron la mayor reducción en la PIO desde el inicio a los 12 meses, con una disminución general del 43,22 %. Es importante destacar que ningún ojo tratado en ningún grupo de dosificación en ningún momento mostró evidencia de hipotonía (PIO ≤ 5 mmHg) durante todo el estudio.

A los 12 meses posteriores a la inyección, se sacrificó una rata macho y una hembra de cada grupo de dosificación para la histología, y los animales restantes se colocaron en una dieta personalizada que contenía tetraciclina al 5% p/p para "apagar" la expresión génica a través de la activación del TC40. y elementos riboswitch TC45 incorporados dentro del genoma del vector. Después de un mes de suplementación dietética con tetraciclina, se repitió la tonometría para determinar si la supresión de la expresión del transgén resultó en una reversión de la PIO hacia la tensión normal. Las ratas BN a las que se les inyectó una dosis baja del vector rAAV2/2[MAX].CCPP no mostraron cambios significativos en la PIO en comparación con las evaluaciones de tonometría posteriores a la inyección o la línea base previa a la inyección, lo que indica que la administración de tetraciclina no tuvo un impacto directo en la PIO ( Fig. 2a, prueba de comparación múltiple de Dunnett, p = 0,4461, N = 9). Es importante destacar que la PIO de ratas BN inyectadas con una dosis media del vector rAAV2/2[MAX].CCPP demostró una reversión casi total a la tensión normal, con un aumento de la PIO del 21,5 % en comparación con las mediciones de 12 meses (Fig. 2c, N = 6) . Los animales que recibieron dosis altas mostraron una reversión significativa a la PIO inicial (Fig. 2e; prueba de comparación múltiple de Dunnett, p = 0,0283, N = 7) con una PIO media que aumentó un 22,5 % en comparación con 12 meses.

Para evaluar si la biosíntesis de novo de PGF2α en la cámara anterior tiene efectos sobre la salud de la retina, realizamos una oftalmoscopia con láser de barrido confocal (cSLO) y una tomografía de coherencia óptica (OCT) al inicio del estudio y a los 12 meses para detectar alteraciones en la reflectancia y el grosor de la retina. respectivamente. Las imágenes de cSLO revelaron un aumento de la reflectancia del infrarrojo cercano (NIR) y una apariencia de fondo de ojo 'rayado' a los 12 meses en los ojos no tratados (control) y en los que se inyectó el vector rAAV2/2[MAX].CCPP en comparación con la línea de base en el nivel bajo (Fig. 1a-d), grupos de dosis media (Fig. 1e-h complementaria) y alta (Fig. 1i-l complementaria), lo que sugiere que cualquier alteración en la morfología retiniana observada ocurrió independientemente del tratamiento o la dosis y, en cambio, probablemente esté relacionada con el envejecimiento normal.

Se analizaron cinco exploraciones B de OCT promediadas a través de la cabeza del nervio óptico en todos los animales al inicio y 12 meses después de la inyección de rAAV2/2[MAX].CCPP en análisis de reflectividad de OCT (ORA) para cuantificar el grosor de la retina (Fig. 2 complementaria)53 . Se generaron 10 perfiles de reflectividad longitudinal (LRP) en incrementos de 250 micras desde el nervio óptico y se usaron para determinar el grosor de la retina medido desde la capa de fibras nerviosas de la retina hasta el RPE (Fig. 3). Se observó una reducción significativa en el grosor de la retina a los 12 meses en los ojos no tratados (Fig. 3a–c) y en los ojos inyectados con el vector rAAV2/2[MAX].CCPP (Fig. 3d–f) en comparación con el valor inicial; al menos una excentricidad en los grupos de dosis alta y baja mostró significación (ANOVA de dos vías, prueba de comparación múltiple de Sidak, p = 0,0123–0,0335 (*), 0,0027–0,0087 (**), 0,0007 (***) y < 0.0001(****), N = 8/grupo), mientras que los ojos tratados con rAAV de dosis media (Fig. 3e), mostraron cierto grado de adelgazamiento, pero no alcanzaron significación (ANOVA de dos vías, prueba de comparación múltiple de Sidak, p > 0,1072, N = 6). Como se ha demostrado el adelgazamiento de la retina en múltiples especies en función de la edad y se observó en ojos tratados y no tratados en todos los grupos de dosis, planteamos la hipótesis de que la reducción del grosor de la retina observada también es el resultado del envejecimiento normal54,55,56,57,58 ,59,60.

Se observó un adelgazamiento significativo de la retina en varias excentricidades del nervio óptico en el punto de tiempo de 12 meses para los ojos no tratados (a–c) y tratados (d, f) en comparación con las mediciones de referencia. No se observó adelgazamiento significativo en los ojos tratados con dosis media (e). (ANOVA bidireccional con prueba de comparación múltiple post hoc de Sidak, p = 0,0123-0,0335 (*), 0,0027-0,0087 (**), 0,0007 (***) y <0,0001(****)). Elementos del gráfico de caja: media = +, línea central = mediana, límites de caja = percentiles 25 y 75, bigotes = mínimo y máximo).

Para investigar si la expresión del transgén CCPP tiene algún efecto adverso sobre la función de la retina, se recolectaron grabaciones de electrorretinograma de campo completo (ffERG) para ojos tratados y no tratados en ratas adaptadas a la oscuridad (Fig. 4). No se encontraron diferencias significativas en las amplitudes de las ondas A y B entre los ojos tratados y no tratados en los grupos de dosis baja (N = 11), dosis media (N = 8) o dosis alta (N = 10) en cualquier intensidad (Fig. 4a-f; múltiples pruebas T no pareadas p> 0.05 todos los grupos, Fig. 3 complementaria). A pesar de las alteraciones relacionadas con la edad en la apariencia y el grosor de la retina, la integridad funcional de la retina en los ojos tratados y contralaterales no tratados se mantuvo durante un período de 12 meses de expresión transgénica CCPP ubicua.

Se muestra la cuantificación de las amplitudes de onda A y B promedio de cada grupo de dosificación (a–f). No se encontraron cambios significativos entre las amplitudes tratadas y no tratadas para las ondas A o B (Pruebas T múltiples, p > 0,05 en todos los grupos. N = 11, 8 y 10 para dosis baja, media y alta respectivamente. Elementos del diagrama de caja: media = +, línea central = mediana, límites de caja = percentiles 25 y 75, bigotes = mínimo y máximo).

Después de la administración intracameral del vector rAAV2/2[MAX].CCPP en ratas BN, buscamos investigar los efectos de la biosíntesis de PGF2α de novo en la salud de la cámara anterior usando OCT para determinar el grosor central de la córnea y la profundidad de la cámara anterior. Las imágenes de OCT de la córnea realizadas a los 12 meses en ojos inyectados con el vector rAAV2/2[MAX].CCPP (tratados) y de control (no tratados) no revelaron diferencias significativas en el espesor corneal central ni en los ojos bajos (p = 0,7541, N = 9 ), ojo tratado con dosis media (p = 0,7475, N = 6) o alta (p = 0,2931, N = 6) (Fig. 5a-c; todas las comparaciones pruebas T no pareadas). Por el contrario, las imágenes de OCT de la cámara anterior revelaron aumentos altamente significativos y dependientes de la dosis en la profundidad de la cámara en baja (Fig. 5d, g; +5.2% p = 0.0125), media (Fig. 5e, h; +8.1%, p = 0,0447) y ojos tratados con dosis alta (Fig. 5f, i; +24,3 %, p = <0,0001) en relación con los ojos de control contralaterales no tratados (todas las comparaciones pruebas T no pareadas).

El grosor de la córnea central no cambió significativamente entre los ojos tratados y no tratados de cualquier grupo de dosificación (a–c). Se encontró que la profundidad de la cámara anterior aumentó significativamente en los ojos tratados con dosis baja (d, g), media (e, h) y alta (f, i) en comparación con los controles no tratados. (Prueba T no pareada: p = 0,7541 (a), p = 0,0447 (b), p = 0,2931 (c), p = 0,0125 (d), p = 0,0447 (e) y p < 0,001 (f). N = 9, 6 y 6, para dosis baja, media y alta, respectivamente Barras de error = SD).

Para determinar si la expresión del transgén CCPP o la biosíntesis de novo de PGF2α causan respuestas inflamatorias en la cámara anterior, las ratas BN se sometieron a exámenes con lámpara de hendidura 12 meses después del tratamiento en busca de evidencia de dispersión de células, destellos o pigmentos, con clasificación realizada por 5 examinadores enmascarados con respecto a la identidad del animal y el tratamiento utilizando un esquema de clasificación modificado de Hackett-McDonald y SUN para la uveítis61,62,63,64,65, según corresponda (Tabla complementaria 1). Se observó un aumento pequeño, pero significativo, en el número de células de la cámara anterior en los ojos inyectados con el vector rAAV2/2[MAX].CCPP de dosis baja en comparación con los controles (Fig. 6ap = 0,0165, N = 9), pero esta tendencia no continuó en ninguno de los dos. los grupos de tratamiento de dosis media o alta (Fig. 6b, c, p = 0,7516 y 0,1099, N = 7 y 5 respectivamente). De manera similar, ningún grupo de dosificación mostró una asociación significativa entre el tratamiento con el vector rAAV2/2[MAX].CCPP y la presencia de brotes (Fig. 6d-f; p = 0,0952, p = 0,3938, p = 0,3451 respectivamente). Por el contrario, se observó que la dispersión del pigmento aumentó significativamente en dosis baja (Fig. 6g, p = 0,0011), media (Fig. 6h, p = 0,0020) y alta (Fig. 6i, p < 0,0001; todas las comparaciones Prueba exacta de Fisher ) Ojos inyectados con el vector rAAV2/2[MAX].CCPP. Además, una rata macho y una hembra del grupo de dosis alta desarrollaron hipema a los 12 meses y requirieron eutanasia.

Las fotografías de examen con lámpara de hendidura calificadas por 5 participantes enmascarados se compararon entre ojos no tratados y tratados para cada grupo de dosis para células (a–c), destellos (d–f) y dispersión del pigmento del iris (g–i). Una prueba exacta de Fisher reveló que en el caso de células de dosis baja (a), la presencia de células dependía de la administración del vector, pero no para los grupos de dosis media o alta (b, c). En todos los casos de erupciones, la prueba exacta de Fisher reveló que la puntuación de las erupciones es independiente de la administración del vector (d–f). De manera similar, todos los grupos de dosis exhibieron una mayor exfoliación del iris que dependía de la administración del vector (g–i). (Prueba exacta de Fisher: valores p= 0,0165 (a), 0,7516 (b), 0,1099 (c), 0,0952 (d), 0,3938 (e), 0,2451 (f), 0,0011 (g), 0,002 (h), y <0.001 (i).N = 9, 7 y 5 para dosis baja, media y alta respectivamente).

La microscopía electrónica completada post mortem a los 12 meses indica que se encontró que la morfología del iris estaba alterada entre los ojos inyectados y no inyectados, y el iris mostraba un adelgazamiento progresivo en función del aumento de la dosis del vector (Fig. 7a-d). La morfología del endotelio corneal no cambió entre el ojo no inyectado y los ojos inyectados en dosis bajas, medias y altas, lo que indica que la expresión de CCPP no afecta negativamente a la morfología de las células endoteliales (Fig. 7e-h).

Se analizaron secciones de microscopía electrónica de cada grupo de dosificación, así como un ojo de control no inyectado de la rata con dosis alta, para determinar las diferencias cualitativas en el iris (a–d) y el endotelio corneal (e–h). Si bien se encontró que las células endoteliales de la córnea no cambiaron, se observó un adelgazamiento progresivo en el iris a medida que aumentaba la dosis del vector. Ampliación = 2000×; barra de escala = 10 μm.

Como la inflamación crónica se ha asociado con la reducción de la PIO66,67,68, buscamos determinar si había alguna relación entre la puntuación de exfoliación de las células, los brotes o el iris con las mediciones de la PIO después de la inyección del vector rAAV2/2[MAX].CCPP en todas las dosis . Específicamente, si la reducción en la PIO observada después de rAAV2/2[MAX].CCPP es causada por la presencia de inflamación crónica, se esperaría una fuerte correlación negativa entre puntajes altos de inflamación y reducción de la PIO. Los análisis de regresión lineal no demuestran una correlación significativa entre células (r2 = 0,02555), destellos (r2 = 0,008490) o exfoliación del iris (r2 = 0,000041; Fig. 8a-c). Para determinar si la inflamación y la dosis del vector son modificadores covariantes de la PIO, comparamos la pendiente de las regresiones lineales para cada métrica inflamatoria (célula, eritema y exfoliación del iris) con mediciones de la PIO y separadas por dosis del vector (baja; N = 9, media; N = 6, o alto, N = 5; Fig. 4 complementaria). Una prueba de comparación múltiple de Tukey no reveló diferencias significativas en las pendientes de regresión entre las dosis para ninguna métrica inflamatoria, incluidas las células (p = 0,6316–0,6563), los destellos (p = 0,06436–0,6669) o la exfoliación del iris (p = 0,6166–0,6994) , lo que indica claramente que la inflamación ocular y la dosificación del vector rAAV2/2[MAX].CCPP no son modificadores de la PIO.

Las regresiones lineales que correlacionan la PIO con la exfoliación de células, destellos e iris (a–c) no muestran correlación entre la reducción de la PIO y la inflamación observada dentro de la cámara anterior. La tinción tricrómica de Masson que indica fibrosis basada en colágeno (colorante azul) se analizó cualitativamente en ojos no tratados (d–f) y tratados contralateralmente (g–i) (ampliación = 20×, barra de escala = 150 µm), y no reveló diferencias obvias entre los ojos tratados. y ojos no tratados en cualquier dosis.

Para determinar si era evidente la fibrosis o atrofia del cuerpo ciliar, que puede reducir potencialmente la producción de humor acuoso y, por lo tanto, reducir la PIO de manera independiente del tratamiento, se realizó inmunohistoquímica utilizando tricrómico de Masson, hematoxilina y eosina (H&E) y ácido peryódico de Schiff. (PAS). La tinción con tricrómico de Masson (Fig. 8d-i) no reveló evidencia de aumento de fibrosis (tinción azul) en rAAV2/2[MAX]. Ojos tratados con CCPP versus ojos de control contralaterales no tratados en cualquier grupo de dosis (Fig. 8d-i). La tinción con H&E (Fig. 5 complementaria) y PAS (Fig. 6 complementaria) no reveló diferencias obvias en la morfología del cuerpo ciliar entre los ojos tratados y no tratados en cualquier grupo de dosificación, lo que indica una ausencia de atrofia del cuerpo ciliar.

Juntos, estos datos indican claramente que la reducción dependiente de la dosis en la PIO observada después del tratamiento con rAAV2/2[MAX].CCPP no está asociada con la inflamación mediada por vectores o transgenes, donde no hubo una correlación significativa entre las métricas inflamatorias, la dosis, y presión Además, no hubo evidencia de lesiones anatómicas macroscópicas (fibrosis o atrofia) que afectaran el cuerpo ciliar que pudieran indicar una reducción sustancial de la producción de humor acuoso.

El cumplimiento del paciente con las terapias farmacológicas existentes (p. ej., gotas para los ojos) para el glaucoma de ángulo abierto es extremadamente pobre debido a una combinación de baja tolerabilidad, dificultades con la autoadministración y falta de retroalimentación negativa inmediata (p. ej., dolor) para reforzar la dosificación adecuada, lo que conduce a frecuentemente al desarrollo de complicaciones que amenazan la visión incluso en pacientes diagnosticados temprano. Con el fin de reducir el incumplimiento del paciente, mejorar los resultados visuales y reducir la carga médica de adherirse a un régimen de tratamiento diario, ha habido un gran interés en el desarrollo de nuevas terapias que actúen para reducir la PIO durante un período prolongado, incluidos los tratamientos implantables. dispositivos farmacológicos y, más recientemente, terapia génica35,69,70,71. Aquí, utilizando una combinación de imágenes multimodales, tonometría, electrofisiología e histología post-mortem, demostramos la eficacia y seguridad de un vector rAAV inyectado intracameralmente que cataliza la biosíntesis de novo de PGF2α y su receptor a partir de células del ángulo iridocorneal y el endotelio corneal. , lo que conduce a una reducción de la PIO a largo plazo (12 meses) dependiente de la dosis. Es importante destacar que demostramos que la inclusión de elementos riboswitch sensibles a la tetraciclina dentro de la construcción de expresión permite que la reducción de la PIO se revierta temporalmente mediante la suplementación de un fármaco activador oral, una característica de seguridad clave para la traducción clínica que permite el cese del tratamiento en el advenimiento de una infección concurrente (p. ej., queratitis herpética) o la capacidad de personalizar la dosificación génica al nivel óptimo de expresión transgénica de paciente a paciente.

Nuestros datos demuestran que la dosis fue un factor en términos de lograr una reducción óptima de la PIO y que, de manera crítica, el grado en que se redujo la presión intraocular en los grupos de dosis media (−21,88 %) o alta (−43,22 %) igualó o superó el logrado con el uso actual enfoques farmacológicos, donde informes previos del uso de Latanoprost en humanos muestran una reducción promedio en la PIO de 24-35% después de 2 años de tratamiento continuo15,72,73,74. La clara relación dependiente de la dosis entre el número de genomas vectoriales administrados y la reducción observada en la PIO es de particular importancia, ya que indica que el tratamiento de terapia génica propuesto para la GAA podría personalizarse según los requisitos de los pacientes individuales. Curiosamente, si bien la dosificación es un factor importante para lograr la reducción deseada de la PIO, también se encontró que la cantidad de genomas de vectores administrados se correlaciona directamente con nuestra capacidad para revertir el efecto del tratamiento a través de la activación de los elementos riboswitch sensibles a la tetraciclina TC40 y TC45 incorporados en el CCPP genoma vectorial como característica de seguridad adicional46. Cuando se sometieron a una dieta de tetraciclina para regular a la baja la expresión transgénica postranscripcional durante un mes, las ratas BN en el grupo de dosis media exhibieron un regreso cercano a la línea de base, mientras que los animales de dosis alta demostraron solo una reversión parcial a la normotensión, lo que indica que hay un grado limitado. a la que la expresión del transgén, y por lo tanto la reducción de la PIO, se puede inactivar utilizando la iteración actual de nuestro casete de expresión. Una posibilidad de no observar una reversión total a la normotensión en los animales tratados con dosis altas puede incluir que la biosíntesis sostenida de PGF2α puede conducir a una remodelación irreversible de la vía de salida uveoescleral, aunque esto no fue evidente de inmediato ni en el microscopio óptico ni en el electrónico. Una explicación alternativa para la única reversión parcial observada es el rango dinámico limitado de los ribointerruptores de tetraciclina utilizados en este estudio, en el que hemos demostrado previamente que los elementos TC45 y TC40 tienen un rango dinámico relativamente pequeño (reducción de ~ 4,6 veces) entre inactivo y estados activos y no 'apagan' por completo la expresión del transgén, lo que hace probable que en los ojos tratados con dosis altas haya una biosíntesis de PGF2α residual suficiente para mantener un grado de reducción de la PIO, incluso cuando se les coloca en una dieta de tetraciclina45. Si se demostrara que esto es correcto, sería beneficioso para futuros estudios y traducción clínica desarrollar riboswitches con mayor rango dinámico y un nivel de expresión más bajo en el estado "apagado" activo. Idealmente, dados los efectos secundarios clínicos conocidos asociados con el uso de tetraciclina a largo plazo (p. ej., disbiosis intestinal y calcificación dental) y las crecientes preocupaciones relacionadas con la resistencia a los antibióticos, cualquier riboswitch novedoso debería diseñarse para responder a un ligando activador que no sea un antibiótico y tiene mayor biodisponibilidad que la tetraciclina, que se ha demostrado que cruza de manera ineficiente la barrera hematoencefálica75,76. Existen varios ribointerruptores alternativos, incluidos aquellos con mayor rango dinámico, incluidos GuaM8HDV y TAP1, que responden a la guanidina HCL y la teofilina, respectivamente, pero se desconoce si estos ligandos se absorben fácilmente a través de la barrera hematoacuosa45,46,77,78, 79,80.

Nuestro estudio demostró que los efectos de la sobreexpresión del transgén CCPP no parecen afectar negativamente ni a la morfología ni a la función de la retina. Aunque el análisis de cSLO y OCT reveló un aumento de NIR y un adelgazamiento significativo de la retina en varias excentricidades del nervio óptico a los 12 meses en comparación con el valor inicial, estos cambios ocurrieron tanto en los ojos tratados como en los no tratados y fueron independientes de la dosis, donde los ojos tratados con dosis bajas (y controles contralaterales) exhibieron un mayor adelgazamiento de la retina que los de los animales tratados con dosis media o alta. En ausencia de una clara relación dependiente de la dosis entre nuestra terapia CCPP y el aumento de la reflectividad o el adelgazamiento de la retina, creemos que los cambios observados están relacionados con el envejecimiento normal, donde se ha demostrado previamente que el adelgazamiento de la retina, especialmente de la capa de fibras nerviosas de la retina, se correlacionan con la edad avanzada en modelos humanos, de ratón y de rata54,55,56,57,58,59,60. Es importante destacar que la función retiniana evaluada por ffERG no se vio afectada en ningún grupo de dosis bajo ningún parámetro de iluminación. En conjunto, estos datos sugieren que la administración intracameral de rAAV2/2[MAX].CCPP y la biosíntesis de novo de PGF2α se toleran bien y no afectan negativamente la salud o la funcionalidad de la retina, y los ojos tratados y no tratados en cada cohorte de dosis muestran un grado similar. de aumento de la reflectividad y adelgazamiento de la retina y sin déficits funcionales observados por ffERG.

Una de nuestras principales consideraciones al evaluar la eficacia de la terapia génica de reducción de la PIO propuesta fue evaluar la salud de la cámara anterior después de la administración del vector intracameral y la expresión prolongada del transgén CCPP. Se encontró que el grosor de la córnea no cambió entre los ojos sin tratar y los tratados a los 12 meses, lo que indica que nuestro tratamiento de terapia génica no afecta negativamente la salud de la córnea y que las mediciones de la PIO tomadas a lo largo del estudio no se habrían confundido por los cambios en el grosor de la córnea en cualquier grupo de dosis. Además, EM reveló que el endotelio corneal, la membrana de Descemet y el estroma tenían una morfología normal sin evidencia de edema, adelgazamiento o deslaminación, lo que indica que la integridad de la córnea y el endotelio no estaban comprometidas. Curiosamente, observamos un aumento significativo y dependiente de la dosis en la profundidad de la cámara anterior, un hallazgo que contrasta con estudios previos que indican que el tratamiento con análogos de prostaglandinas conduce a una disminución de la profundidad de la cámara anterior81,82. Sin embargo, estos estudios solo observaron los efectos a corto plazo del uso de latanoprost y pilocarpina en pacientes glaucomatosos, en los que se puede esperar que la profundidad de la cámara anterior sea más profunda que en los controles de la misma edad y sexo como resultado directo de la PIO elevada82. Como consecuencia, es posible que la profundización de la cámara anterior observada en este estudio pueda ser un artefacto del uso de animales normotensos a lo largo del estudio, de los que se esperaría que tuvieran curvaturas corneales basales normales y, por lo tanto, pueden mostrar alteraciones pronunciadas en la profundidad de la cámara cuando la PIO es alta. reducido artificialmente a través de un tratamiento de terapia génica. Alternativamente, también es posible que la biosíntesis de novo de PGF2α dentro de la cámara anterior conduzca a una remodelación uveoescleral más extensa que la que se observa cuando los análogos de prostaglandinas se aplican tópicamente a la superficie de la córnea, ya que solo el 5-10% de cada gota es absorbida por la córnea y el resto es mal absorbido por los tejidos circundantes83,84,85,86. No está claro a través de qué mecanismo la biosíntesis intraocular sostenida de PGF2α está afectando la profundidad de la cámara anterior, sin embargo, aunque la OCT parecería mostrar que la córnea central de los ojos con dosis altas está más curvada, lo que indica que la córnea se ha "abultado", en lugar de el cristalino y el iris se han movido hacia atrás. Además de la reducción mayor a la deseada de la PIO en los ojos con dosis altas, la profundización de la cámara anterior también es preocupante, ya que probablemente tendría un impacto adverso en la visión del paciente, donde estudios previos han demostrado que después de la inserción de la LIO en pacientes con cataratas, la cámara anterior también es preocupante. los aumentos de profundidad de la cámara de 1 mm pueden causar un cambio miópico en los errores de refracción que aumentan hasta 0,32 dioptrías87,88.

La puntuación de células y brotes realizada por observadores enmascarados no reveló un aumento significativo de la inflamación dependiente de la dosis, lo que indica que la inyección de rAAV en la cámara anterior y la expresión a largo plazo del casete del transgén CCPP se toleran bien. Por el contrario, aunque se encontró que la inflamación de la cámara anterior era insignificante, se observó dispersión del iris en todos los grupos de dosis, y los animales que recibieron dosis altas mostraron niveles muy significativos de migración de melanocitos que se correlacionaron fuertemente con el adelgazamiento del iris según lo evaluado por microscopía electrónica. No es posible determinar a partir del presente estudio si la exfoliación del iris dependiente de la dosis resultó de la expresión directa del transgén CCPP dentro de los melanocitos, donde el serotipo rAAV2/2[MAX] es capaz de transducir células del iris, o si es relacionado con concentraciones crecientes de PGF2α dentro de la cámara anterior a dosis de vector más altas. Independientemente, la observación de dispersión de pigmento dependiente de la dosis probablemente contraindicaría el uso de la terapia génica rAAV.CCPP descrita para reducir la PIO en pacientes con glaucoma congénito (p. ej., Axenfeld-Rieger) o de dispersión de pigmento cuyos iris ya pueden ser inestables y cuya degradación puede acelerarse mediante la transducción del iris con AAV o la expresión del transgén CCPP y la biosíntesis de PGF2α. Sin embargo, dada la falta de compromiso del iris en la fisiopatología de la hipertensión ocular en el GAA (a diferencia del glaucoma congénito o de ángulo cerrado), probablemente sería beneficioso investigar la selección de serotipos de rAAV naturales o modificados que no transduzcan el iris a eliminar la posibilidad de que la expresión directa de CCPP provoque la exfoliación del iris al tratar el glaucoma de dispersión pigmentaria o OAG.

Otra preocupación importante al evaluar la eficacia de un tratamiento de terapia génica que funciona mediante la modulación de la vía biológica para sintetizar PGF2α de novo a partir de células de la cámara anterior, es si cualquier reducción observada en la PIO puede atribuirse a la acción farmacológica de PGF2α sobre la remodelación uveoescleral. , sino por inflamación crónica en respuesta a la inyección de viriones de rAAV en la cámara anterior o la expresión posterior del transgén terapéutico. Esta preocupación es particularmente relevante cuando se evalúa un tratamiento novedoso para el glaucoma, donde se sabe que la inflamación sostenida de bajo grado reduce la PIO en pacientes humanos y, por lo tanto, también puede ser una variable de confusión en modelos animales experimentales, como la rata Brown Norway66,67 ,68. Al realizar una serie de análisis de covarianza y regresión lineal, pudimos demostrar con éxito que la dosis del vector (baja, media o alta) y la gravedad de la inflamación (graduada según la exfoliación de las células, los brotes y el iris) no son mediadores significativos de la reducción de la PIO. , lo que indica claramente que la reducción de la PIO dependiente de la dosis observada en los grupos de tratamiento estuvo mediada principalmente por la acción biológica del transgén CCPP administrado. De hecho, el único análisis de regresión que se acercó a la significación estadística fue la relación entre la exfoliación del iris y la PIO en el grupo de tratamiento de dosis alta (Fig. 4I complementaria), que tiende hacia una pendiente positiva con una puntuación más alta de inflamación correlacionada con una PIO más alta; exactamente la tendencia opuesta a la esperada si la inflamación crónica fuera responsable de la reducción de la PIO observada en este estudio.

Una limitación de este trabajo es que los ojos de control no tratados eran contralaterales a los ojos inyectados en todas las cohortes de dosis. Específicamente, los estudios han demostrado que la inyección de rAAV en un ojo puede afectar el ojo contralateral, como se vio en los ensayos preclínicos para la amaurosis congénita de Leber, en los que se encontró ADN viral tanto en la cámara anterior inyectada como en la no inyectada, retinas y nervios ópticos de primates no humanos después de la inyección del vector intravítreo89. Esto plantea la posibilidad de que las alteraciones en la reflectividad y el grosor de la retina observadas en nuestro estudio puedan surgir de la diafonía entre los ojos inyectados y contralaterales no inyectados, en lugar de ser el resultado del envejecimiento normal. Sin embargo, creemos que esto es poco probable por las siguientes razones: (1) la expresión de CCPP y la producción de PGF2α no fueron suficientes en los grupos de dosis bajas para alterar la PIO dentro del ojo tratado, por lo que parecería ilógico que una actividad de nivel tan bajo podría afectar negativamente a la salud de la retina en el ojo contralateral no inyectado; (2) no se observó que el aumento de la reflectividad y el adelgazamiento de la retina fueran dependientes de la dosis en los ojos tratados o no tratados, lo que se esperaría si fuera atribuible a la presencia de genomas vectoriales o a la expresión de PGF2α en el ojo contralateral, donde la diafonía volvería a ser se espera que sea mayor en ratas BN tratadas con dosis altas; (3) estudios previos han demostrado que la profundidad media de la cámara anterior en ratas BN es de 778 ± 42,7 micrones, que es similar a nuestros hallazgos de 12 meses en ojos no tratados en todas las dosis;90 (4) el ojo de control presentado para el estudio de microscopía electrónica se obtuvo de una rata tratada con una dosis alta y no demostró cambios morfológicos adversos (p. ej., exfoliación/adelgazamiento del iris), que se habrían esperado si se hubiera producido una diafonía entre los ojos inyectados y no inyectados.

En conclusión, el tratamiento de ratas Brown Norway normotensas con rAAV2/2[MAX].CCPP resultó en una reducción de la PIO dependiente de la dosis, y los ojos con dosis media exhibieron una reducción clínicamente relevante de la hipertensión ocular sin el desarrollo de efectos secundarios adversos. De manera crítica, la reducción de la PIO podría revertirse mediante la administración de un ligando oral, una característica de seguridad crítica para la traducción clínica que permite la interrupción temporal del tratamiento en caso de una reacción adversa o la necesidad de resolver una infección comensal. Si bien se observó exfoliación del iris y profundización de la cámara anterior en ratas BN tratadas con dosis altas, estos animales también exhibieron una reducción de la PIO mayor que la clínicamente relevante y, como tal, parecería representar una sobredosis del vector rAAV2/2[MAX].CCPP . La investigación futura para determinar los efectos de esta terapia en modelos animales glaucomatosos, así como descubrir la combinación óptima de tropismo de la cápside del vector y ribointerruptor ajustable para limitar los efectos secundarios observados en dosis altas del vector aumentaría la traducibilidad de la terapia única de acción prolongada descrita. utilizar el tratamiento de terapia génica para el glaucoma de ángulo abierto.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Wisconsin y se adhieren a la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Se obtuvieron ratas BN de 6 a 8 semanas de edad (N = 30: 15 machos y 15 hembras) de Charles River Laboratories (BN/Crl, Wilmington, MA, EE. UU.) y se alojaron en un fotoperíodo de luz/oscuridad de 12:12 h con dieta y agua proporcionada ad libitum. Además, se obtuvieron 3 ratas BN para experimentos de tropismo. Para las evaluaciones que requerían anestesia general, los animales se colocaron en una cámara de inducción (VetEquip, Livermore, CA) y se sedaron mediante inhalación de isoflurano (5 % de inducción, 1–2,5 % de mantenimiento) provisto de oxígeno (100 %, 0,2–1 l/min). ). La dilatación de la pupila se logró mediante la colocación de gotas oftálmicas midriáticas tópicas que contenían fenilefrina HCL al 2,5 % y tropicamida al 1 % (Akorn, Lake Forest, IL, EE. UU.).

Las células HEK293T (ATCC no. CRL-11268; Manassas, VA, EE. UU.) se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa + Glutamax (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) antimicótico Las células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 3,0 × 105 células/pocillo y luego se transfectaron usando polietilenimina (PEI) (Polysciences, #23966-100, PA, EE. UU.) con una confluencia de ~70 % con 2 µg de smCBA-TC40- Plásmido COX2-P2A-PTGFR-TC45 en suero reducido (2%) DMEM + medio Glutamax. Después de 72 h, se recogieron los medios de los pocillos y se analizaron por duplicado utilizando un kit ELISA comercial para cuantificar los niveles de PGF2α (Abcam, ab133056, Cambridge, Reino Unido).

Brevemente, las células HEK293T se sometieron a una transfección triple con (1) un plásmido que expresaba los genes Rep y Cap para el vector rAAV2/2[MAX] mutante de la cápside; (2) un plásmido auxiliar que expresa genes derivados de adenovirus necesarios para el empaquetamiento; y (3) el plásmido de expresión transgénica (smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45; para obtener información sobre la secuencia, consulte el número de patente US20200063137A1) en proporciones equimolares (1:1:1) utilizando PEI52. Las células se cultivaron en hiperfrascos (Corning, Corning, NY) durante 72 h después de la transfección en DMEM + Glutamax con FBS al 2 % y antibiótico-antimicótico al 1 %. Después de 72 h, el vector se purificó mediante centrifugación en gradiente de densidad de iodixanol y concentración mediante intercambio de tampón, como se describió anteriormente91,92. A continuación, se combinaron un total de 5 preparaciones de vectores de rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-PTGFR-TC45 y se concentraron mediante intercambio de tampón en una columna de filtro de 100 kDa para aumentar los títulos virales (Amicon, Darmstadt, Alemania). Los títulos de rAAV se determinaron a través de un ensayo PicoGreen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) que produjo 240 μl de 3,9 × 1013 vg/mL (genomas de vector/mL)93. Los vectores se diluyeron en HBSS + Tween-20 al 0,014 % para proporcionar un aumento de dosis de tres logaritmos para la inyección: 3,9 × 109 vg/ojo (bajo), 3,9 × 1010 vg/ojo (medio) y 3,9 × 1011 vg/ojo ( alto). Para los experimentos de tropismo in vivo, se preparó una preparación de un solo vector de rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry de forma similar al proceso descrito anteriormente, lo que produjo 80 μl de 1,17 × 1013 vg/ml.

Se anestesiaron treinta ratas BN y se les dilataron las pupilas antes de recibir una inyección intracameral unilateral de rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45 a una concentración baja (3,9 × 109 vg), media (3,9 × 1010 vg), o una dosis alta (3,9 × 1011 vg) suspendida en 10 μl de HBSS + 0,014 % de Tween 20 con una pequeña cantidad de fluoresceína para visualizar el reflujo. Brevemente, bajo un microscopio quirúrgico oftálmico (Leica, Wetzlar, Alemania) se colocó un cubreobjetos de vidrio redondo de 6 mm (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EE. Lake Forest, IL, EE. UU.) antes de que las puntas de unas pinzas rectas con muescas de 0,12 mm (n.º 0109025, Haag-Streit John Weiss, Reino Unido) se hicieran avanzar en la parte posterior del globo ocular para asegurar un músculo extraocular y evitar la rotación del ojo. A continuación, se hizo avanzar una aguja biselada de 33 G de 10 mm unida a una jeringa Hamilton de 100 μl a través de la córnea aproximadamente 1 mm por delante del limbo hasta que la punta de la aguja estuvo en el centro de la cámara anterior. Después de la inyección de 10 μl de vector purificado, la punta de la aguja se mantuvo en posición hasta que la PIO se estabilizó, lo que se indica visualmente mediante la limpieza del estroma corneal y la reanudación de la perfusión retiniana normal, para limitar el reflujo excesivo. De manera similar, tres ratas BN se sometieron a inyecciones intracamerales bilaterales de rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry para experimentos de tropismo in vivo que recibieron 1,13 × 1011 vg cada una.

La presión intraocular se midió con un tonómetro de rebote portátil TonoLab (iCare, Oy, Finlandia) calibrado para uso en ratas al inicio y 1, 2, 6, 9, 12 y 13 meses después de la inyección. Todas las lecturas se realizaron en animales no anestesiados dentro de un período de tiempo definido (11:00–13:00) para limitar la variabilidad de la PIO relacionada con el ritmo circadiano; todos los investigadores involucrados en la toma de medidas de la PIO estaban enmascarados con respecto a la dosis del vector. Brevemente, el tonómetro se aseguró en una posición horizontal usando un soporte de retorta y la rata se colocó usando una restricción física suave para que el ojo de prueba estuviera a ~1 mm de distancia y orientado perpendicularmente a la sonda del tonómetro. Cada medición de PIO es el promedio de tres registros independientes. Después de completar la evaluación, las ratas fueron recompensadas con golosinas Bacon Yummies (Bio-Serv, Flemington, NJ, EE. UU.) para prepararlas para manipularlas sin anestesia.

Los animales se sometieron a evaluaciones de fondo de ojo preliminares y de 12 meses con un cSLO multilínea personalizado (Spectralis HRA modificado; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania). Después de la dilatación de las pupilas, la alineación de la cámara se facilitó mediante el uso del modo de imagen de reflectancia de infrarrojo cercano (820 nm), lo que garantiza que la imagen del fondo de ojo se ilumine uniformemente y que el disco óptico esté correctamente centrado. Las imágenes capturadas son fotogramas individuales.

A los 12 meses, todos los animales se sometieron a biomicroscopía con lámpara de hendidura (Topcon SL-D8Z, Topcon Medical Systems, Oakland, CA, EE. UU.) con imágenes de ojos tratados y no tratados capturadas con una cámara digital (D810, Nikon, Japón). Para evaluar las células y los destellos, se generó una imagen de lámpara de hendidura utilizando un haz de hendidura de 1 mm que abarcó el diámetro del globo y se evaluó la exfoliación del iris en imágenes de campo amplio obtenidas con un haz de 20 mm. Para la clasificación, las imágenes de la lámpara de hendidura se anonimizaron y se presentaron a cinco evaluadores independientes en orden aleatorio para garantizar que los evaluadores estuvieran enmascarados con respecto a la dosis de vector y la identidad del animal. La clasificación se realizó de acuerdo con el esquema de clasificación SUN para células y destellos de la cámara anterior y un esquema de clasificación Hackett-McDonald modificado para la exfoliación del iris (Tabla complementaria 1).

Las ratas BN se sometieron a evaluaciones de electrorretinografía al inicio y 12 meses después de la inyección. Las ratas se adaptaron a la oscuridad durante la noche y todas las manipulaciones experimentales se realizaron bajo una iluminación roja tenue. Para la grabación se utilizó un sistema Espion E2 conectado a un Color Dome (Diagnosys LLC, Cambridge, Reino Unido) con filtros Bessel instalados para 0, 1000 y 60 Hz colocados en una jaula de Faraday para reducir el ruido eléctrico. Después de la anestesia con isoflurano, las ratas se colocaron en un escenario calentado para mantener la temperatura corporal mientras se aplicaban gotas oculares lubricantes Refresh en las córneas para mantener la hidratación y proporcionar conductividad eléctrica. Se insertaron electrodos subdérmicos de núcleo sólido en el cuero cabelludo y las ancas que sirvieron como electrodos de referencia y de tierra, respectivamente, mientras que se colocaron electrodos de bucle de alambre de oro en la córnea de ambos ojos. Las respuestas se registraron después de estímulos breves (4 ms) de un solo destello blanco (1 Hz) en una serie de luminancia de 6 log (-4 a 0,48 log cd.s/m2). Las amplitudes de las ondas A y B se midieron utilizando el software Espion E2 (Diagnosys LLC, Cambridge, Reino Unido).

La tomografía de coherencia óptica (OCT) retinal se completó en ratas BN al inicio del estudio ya los 12 meses. La obtención de imágenes se realizó utilizando un OCT de dominio espectral Bioptigen Envisu R2200 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) equipado con un orificio específico para retina de rata. Se obtuvieron escaneos de volumen rectangular (1000 A-scans/B-scan, 650 B-scans) de la retina y las imágenes se exportaron al software FIJI con el complemento lector OCT instalado, donde se promediaron 5 cuadros centrados en el disco óptico. Luego, las imágenes resultantes se exportaron al software OCT Reflectivity Analysis (ORA), donde se registraron las mediciones del grosor de la retina desde la NFL hasta el RPE en 10 perfiles de reflectividad longitudinal con excentricidades de 250 micras desde el disco óptico53. La OCT de cámara anterior se completó a los 12 meses en la OCT R2200 con un calibre telecéntrico de 12 mm (1000 A-scans/B-scan, 650 B-scans). Las imágenes capturadas se midieron con calibradores para el espesor de la córnea central y la profundidad de la cámara anterior en el software Bioptogen InVivoVue.

Globos completos inyectados con rAAV2.2[MAX]-mCherry se enuclearon y se fijaron durante la noche en paraformaldehído (PFA) al 4 % a 4 °C. Luego, los ojos se movieron a una solución de sacarosa al 30 % en PBS durante 24 h a 4 °C antes de enjuagarlos en PBS y se incluyeron en medios de temperatura de corte óptima Tissue-Tek (Sakura, Torrance, CA). A continuación, los bloques OCT se seccionaron en incrementos de 14 µm en un criostato Leica CM1860 (Leica, Buffalo Grove, IL) en portaobjetos Fisherbrand Superfrost Plus y se dejaron secar durante la noche. Las secciones se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Las muestras se descongelaron a temperatura ambiente durante 2 h, la OCT se lavó en PBS y las secciones se contratiñeron con Hoechst 33342 para visualizar los núcleos. Se tomaron imágenes de las secciones con un microscopio confocal Nikon Eclipse 80i (Nikon, Minato, Tokio, Japón) utilizando el objetivo de 20x y se procesaron como proyecciones de máxima intensidad y se fusionaron en el software FIJI.

Globos completos inyectados con el vector transgénico CCPP se fijaron en PFA al 4 % durante la noche y el tejido se deshidrató con etanol graduado, se aclaró con xileno, se infiltró en parafina (Sakura Tissue Tek-VIP5; procesador de tejido automatizado) y se incrustó en bloques de tejido (Tissue Tek-TEC , centro de inclusión). Los bloques de tejido se seccionaron a 4 µm (Microm HM355s) y se montaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina. Luego, las secciones se desparafinizaron con xileno, se rehidrataron y se tiñeron con hematoxilina y eosina usando una plataforma de tinción automática (Sakura Prisma) y se tiñeron manualmente para el ácido peryódico Schiff y tricrómico de Masson usando un protocolo estándar desarrollado por Medical College of Wisconsin's Children's Research Institute Histology Core.

Se enuclearon globos completos de cada grupo de dosificación asignado para microscopía electrónica de transmisión y se fijaron en paraformaldehído al 2 %, glutaraldehído al 2 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante la noche a 4 °C. Después de la fijación, se completó la disección de los globos para obtener muestras que contenían la córnea, el ángulo iridocorneal y la retina anterior y el tejido se fijó posteriormente en tetróxido de osmio al 1% en hielo. Después de la fijación posterior, el tejido se deshidrató en una serie de metanol (50-100 %) y se infundió con acetonitrilo. Luego, las muestras de tejido se incluyeron en 100 % Embed 812 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU.) y se hornearon a 60 °C durante la noche. Las muestras incrustadas fueron procesadas por el Medical College of Wisconsin Electron Microscopy Core, donde se realizaron secciones de 70 nm utilizando un ultramicrótomo PowerTome MT-XL (RMC Boeckeler, Tucson, AZ, EE. UU.), colocados en rejillas hexagonales de malla 200 (Electron Microscopy Science) y teñido con acetato de uranilo y citrato de plomo. Se tomaron imágenes de las secciones teñidas en un microscopio electrónico de transmisión H-600 (Hitachi High Technologies, Schaumburg, IL, EE. UU.) con un aumento de 2000x.

Todo el análisis estadístico se completó en GraphPad Prism 7 (GraphPad, La Jolla, CA, EE. UU.) para determinar la significación estadística entre los grupos. Se utilizó una prueba de Shapiro-Wilk para determinar que todos los conjuntos de datos eran normales (α = 0,05). Se utilizaron pruebas T no pareadas para analizar los datos de ELISA, la profundidad de la cámara y el grosor de la córnea. Un ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de comparación múltiple de Sidak determinó diferencias significativas en los datos del grosor de la retina. Se utilizaron múltiples pruebas T no pareadas para determinar las diferencias entre los datos de ERG. Se utilizó un análisis de efectos mixtos con una prueba post hoc de comparaciones múltiples de Dunnett y una regresión lineal simple para analizar los datos de la PIO. Los datos de la lámpara de hendidura se analizaron utilizando la prueba exacta de Fisher. Para determinar si era evidente una correlación entre la reducción de la PIO y la inflamación, se completaron regresiones lineales simples para las métricas inflamatorias frente a la PIO a los 12 meses. Además, para probar si la inflamación era un mediador de la reducción de la PIO, se compararon las pendientes de regresión lineal para cada grupo de dosis con una prueba de comparación múltiple de Tukey.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o en los materiales complementarios. Los datos sin procesar utilizados para generar cifras de IOP, OCT, ERG y lámpara de hendidura están disponibles en Figshare en el siguiente https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21280383. Cualquier otra solicitud podrá ser comunicada al autor de correspondencia.

Quigley, H. & Broman, AT Número de personas con glaucoma en todo el mundo en 2010 y 2020. Br. J. Oftalmol. 90, 262–267 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weinreb, RN & Khaw, PT Glaucoma primario de ángulo abierto. Lanceta 363, 1711-1720 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Gedde, SJ et al. Patrón de práctica preferida para el glaucoma primario de ángulo abierto®. Oftalmología 128, P71–P150 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Kiang, KS, Chong, HMH & Kraft, M. El estudio de intervención de glaucoma avanzado (AGIS): 7. La relación entre el control de la presión intraocular y el deterioro del campo visual. proc. Ing. 5, 1462–1465 (2010).

Artículo Google Académico

Almasieh, M., Wilson, AM, Morquette, B., Cueva Vargas, JL & Di Polo, A. La base molecular de la muerte de las células ganglionares de la retina en el glaucoma. prog. Retin. ojo Res. 31, 152–181 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Conlon, R., Saheb, H. & Ahmed, IIK Tendencias en el tratamiento del glaucoma: una revisión. Poder. J. Oftalmol. 52, 114–124 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Meier-Gibbons, F., Berlin, MS & Töteberg-Harms, M. Influencia de las nuevas modalidades de tratamiento en la adherencia al glaucoma. actual Opinión Oftalmol. 30, 104–109 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Realini, T. Una historia de la farmacología del glaucoma. Opta. Vis. ciencia 88, 36–38 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Centro Nacional de Información Biotecnológica. Base de datos PubChem. Travoprost, CID=5282226, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Travoprost (Consultado el 23 de julio) (2019).

Centro Nacional de Información Biotecnológica. Base de datos PubChem. Latanoprost, CID=5311221, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Latanoprost (Consultado el 23 de julio) (2019).

Christiansen, GA, Nau, CB, McLaren, JW & Johnson, DH Mecanismo de acción hipotensora ocular de bimatoprost (Lumigan) en pacientes con hipertensión ocular o glaucoma. Oftalmología 111, 1658–1662 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Dinslage, S., Hueber, A., Diestelhorst, M. & Krieglstein, GK La influencia de Latanoprost 0.005% en el flujo de humor acuoso y la facilidad de flujo de salida en pacientes con glaucoma: un estudio clínico doble ciego controlado con placebo. Arco de Graefe. clin. Exp. Oftalmol. 242, 654–660 (2004).

Artículo Google Académico

Weinreb, RN, Toris, CB, Gabelt, BT, Lindsey, JD y Kaufman, PL Efectos de las prostaglandinas en las vías de salida del humor acuoso. sobrev. Oftalmol. 47, S53–64 (2002).

Zimmerman, TJ, Baumann, JD y Hetherington, J. Efectos secundarios del timolol. sobrev. Oftalmol. 28, 243–249 (1983).

Artículo PubMed Google Académico

Alm, A. & Widengård, I. Latanoprost: Experiencia de tratamiento de 2 años en Escandinavia. Acta Oftalmol. Escanear. 78, 71–76 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Alm, A. & Stjernschantz, J. Efectos sobre la presión intraocular y efectos secundarios de latanoprost al 0,005 % aplicado una vez al día, por la noche o por la mañana: una comparación con timolol. Oftalmología 102, 1743–1752 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Makri, OE et al. Edema macular cistoideo asociado con latanoprost sin conservantes después de una cirugía de cataratas sin complicaciones: reporte de un caso y revisión de la literatura. Resolución BMC. Notas 10, 1–6 (2017).

Artículo Google Académico

Wand, M., Gilbert, CM & Liesegang, TJ Latanoprost y queratitis por herpes simple. Soy. J. Oftalmol. 127, 602–604 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Friedman, DS et al. Uso de datos de reclamos de farmacia para estudiar la adherencia a los medicamentos para el glaucoma: Metodología y hallazgos del Estudio de adherencia y persistencia del glaucoma (GAPS). investigando Oftalmol. Vis. ciencia 48, 5052–5057 (2007).

Artículo Google Académico

Okeke, CO et al. Adherencia a la medicación tópica para el glaucoma monitoreada electrónicamente. El estudio de ayuda de dosificación de Travatan. Oftalmología 116, 191–199 (2009).

Artículo PubMed Google Académico

Schmidt, W. et al. Nuevos conceptos para implantes de glaucoma: drenaje controlado del humor acuoso, prevención de la encapsulación y administración local de fármacos. actual Farmacia Biotecnología. 14, 98–111 (2013).

CAS PubMed Google Académico

Sello, JR et al. El implante intracameral de bimatoprost de liberación sostenida administra bimatoprost a los tejidos diana con una exposición reducida al fármaco en los tejidos no diana. J. Ocul. Farmacol. El r. 35, 50–57 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Craven, ER et al. Ensayo clínico de fase I/II de 24 meses del implante de liberación sostenida de bimatoprost (Bimatoprost SR) en pacientes con glaucoma. Drogas 80, 167–179 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shirley, M. Implante de bimatoprost: primera aprobación. Drogas Envejecimiento 37, 457–462 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Medeiros, FA et al. Estudio de fase 3, aleatorizado, de 20 meses de duración del implante de bimatoprost en glaucoma de ángulo abierto e hipertensión ocular (ARTEMIS 1). Oftalmología 127, 1627–1641 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Lee, SS et al. El implante intracameral de liberación sostenida de bimatoprost reduce la presión venosa epiescleral en perros. Veterinario. Oftalmol. 21, 376–381 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Carta, TM Durysta: un implante de bimatoprost para el glaucoma. Medicina. Letón. Drogas Ther. 62, 116–117 (2020).

Ojha, P., Wiggs, JL & Pasquale, LR La genética de la presión intraocular. Semin. Oftalmol. Rev. 28, 301–305 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

O'Callaghan, J. et al. Potencial terapéutico de la secreción de MMP-3 mediada por AAV del endotelio corneal en el tratamiento del glaucoma. Tararear. mol. Gineta. 26, 1230–1246 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

WuDunn, D. Bases genéticas del glaucoma. actual Opinión Oftalmol. 13, 55–60 (2002).

Artículo PubMed Google Académico

Wang, L., Xiao, R., Andres-Mateos, E. & Vandenberghe, LH El virus adenoasociado monocatenario logra una transferencia génica eficiente al segmento anterior en el ojo del ratón. PLoS One 12, 1–12 (2017).

Google Académico

Taylor, A. Privilegio inmune ocular. Ojo 23, 289-3131885–1889 (2009).

Artículo Google Académico

Hori, J., Yamaguchi, T., Keino, H., Hamrah, P. y Maruyama, K. Privilegio inmunológico en el trasplante de córnea. prog. Retin. ojo Res. 72, 100758 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liu, MM, Tuo, J. & Chan, CC Terapia génica para enfermedades oculares. Hermano J. Oftalmol. 95, 604–612 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Borrás, T., Brandt, CR, Nickells, R. & Ritch, R. Terapia génica para el glaucoma: tratamiento de una enfermedad crónica multifacética. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 43, 2513–2518 (2002).

Google Académico

Benjaminy, S., Kowal, SP, MacDonald, IM & Bubela, T. Comunicando la promesa de las terapias génicas oculares: Desafíos y recomendaciones. Soy. J. Oftalmol. 160, 408–415.e2 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

Roy, K., Stein, L. y Kaushal, S. Terapia génica ocular: una evaluación de las intervenciones de terapia génica mediada por virus adenoasociados recombinantes para el tratamiento de enfermedades oculares. Tararear. Gene Ther. 21, 915–927 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bainbridge, JWB et al. Efecto a largo plazo de la terapia génica en la amaurosis congénita de Leber. N. ingl. J.Med. 372, 1887–1897 (2015).

Russell, PS et al. Eficacia y seguridad de voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) en pacientes con distrofia retiniana hereditaria mediada por RPE65: un ensayo de fase 3 aleatorizado, controlado y abierto 390, 849–860 (2018).

Google Académico

Cehajic Kapetanovic, J., Barnard, AR & MacLaren, RE Terapias moleculares para la coroideremia. Genes (Basilea) 10, 738 (2019).

Gruntman, AM & Flotte, TR El estado de rápida evolución de la terapia génica. FASEB J. 32, 1733–1740 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Darrow, JJ Luxturna: Los documentos de la FDA revelan el valor de una costosa terapia génica. Descubrimiento de drogas Hoy 24, 949–954 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Bazan, HEP & Bazan, NG Composición de fosfolípidos y ácidos grasos libres e incorporación de ácido araquidónico marcado en córnea de conejo. Comparación de epitelio, estroma y endotelio. actual ojo Res. 3, 1313–1320 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Barraza, RA, McLaren, JW & Poeschla, EM Terapia génica de la vía de las prostaglandinas para la reducción sostenida de la presión intraocular. mol. El r. 18, 491–501 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Reid, CA, Nettesheim, ER, Connor, TB y Lipinski, DM Desarrollo de una estrategia de terapia génica anti-VEGF rAAV inducible para el tratamiento de la AMD húmeda. ciencia Rep. 8, 1–14 (2018).

Artículo Google Académico

Zhong, G., Wang, H., Bailey, CC, Gao, G. y Farzan, M. Diseño racional de ribointerruptores de aptazimas para el control eficiente de la expresión génica en células de mamíferos. Elife 5, e18858 (2016).

Salminen, L. Penetración de los compartimentos oculares por tetraciclinas. Albr. Von. Arco Graefes. Klin. Oftalmol. 204, 189–199 (1977).

Artículo CAS Google Académico

Kroll, DM & Schuman, JS Reactivación de la queratitis por el virus del herpes simple después de iniciar el tratamiento con bimatoprost para el glaucoma. J. Oftalmol. 133, 401–403 (1989).

Google Académico

Alm, A., Grierson, I. y Shields, MB Efectos secundarios asociados con la terapia con análogos de prostaglandina. sobrev. Oftalmol. 53, S93–105 (2008).

Kay, CN et al. Dirigirse a los fotorreceptores a través de la administración intravítrea utilizando nuevos vectores AAV mutados en la cápside. PLoS One 8, e62097 (2013).

Dalkara, D. et al. Evolución dirigida in vivo de un nuevo virus adenoasociado para la administración terapéutica de genes de la retina externa desde el vítreo. ciencia Traducir Medicina. 5, 189ra76 (2013).

Reid, CA, Ertel, KJ y Lipinski, DM Mejora de la orientación de los fotorreceptores a través de la administración intravítrea en retina humana y de ratón utilizando vectores mutantes de la cápside rAAV2 combinatorios. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 58, 6429–6439 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Wilk, MA, Wilk, BM, Langlo, CS, Cooper, RF y Carroll, J. Evaluación de la longitud del segmento externo como medida sustituta de la densidad máxima del cono foveal. Vis. Res. 130, 57–66 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Parikh, RS et al. Deterioro normal relacionado con la edad del grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina. Oftalmología 114, 921–926 (2007).

Artículo PubMed Google Académico

Eriksson, U. & Alm, A. El grosor macular disminuye con la edad en ojos normales: un estudio sobre el protocolo del mapa de grosor macular en el Stratus OCT. Hermano J. Oftalmol. 93, 1448–1452 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shariati, MA, Park, JH & Liao, YJ Estudio de tomografía de coherencia óptica de los cambios en la retina en el envejecimiento normal y después de la isquemia. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 56, 2790–2797 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Wu, Z. et al. Impacto de las definiciones normales de envejecimiento y progresión en la especificidad de detectar el adelgazamiento de la capa de fibras nerviosas de la retina. Soy. J. Oftalmol. 181, 106–113 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Nadal-Nicolás, FM, Vidal-Sanz, M. & Agudo-Barriuso, M. La retina de rata envejecida: de la función a la anatomía. Neurobiol. Edad 61, 146–168 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Patil, MA & Kompella, UB Monitoreo no invasivo de la autofluorescencia coroides-retina y la disposición de nanopartículas intravítreas en ratas del Royal College of Surgeon de diferentes edades y adelgazamiento de la retina. J. Ocul. Farmacol. El r. 36, 458–466 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Canción, W. et al. Integración de la oftalmoscopia fotoacústica con la oftalmoscopia láser de barrido, la tomografía de coherencia óptica y la angiografía con fluoresceína para una plataforma multimodal de imágenes de la retina. J. Biomédica. Optar. 17, 061206 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Jabs, D., Nussenblatt, R. & Rosenbaum, J. Grupo de trabajo de estandarización de la nomenclatura de uveítis. Estandarización de la nomenclatura de uveítis para informar datos clínicos. Soy. J. Oftalmol. 140, 509–516 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Jabs, DA et al. Estandarización de la nomenclatura de uveítis para informar datos clínicos. Resultados del primer taller internacional. Soy. J. Oftalmol. 140, 509–516 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Hackett, RB & MacDonald, TO Dermatotoxicology (eds Marzulli, F. & Maibach, H.) 557–567 (Taylor & Francis, 1996).

Munger, RJ Oftalmología veterinaria en estudios con animales de laboratorio. Veterinario. Oftalmol. 5, 167–175 (2002).

Artículo PubMed Google Académico

Kanski, J. Clinical Ophthalmolgy 263–319 (Butterworth-Heinemann, 2000).

Sen, HN et al. Hipotonía en pacientes con uveítis: el ensayo Multicenter Uveitis Steroid Treatment (MUST). Ocul. inmunol. inflamacion 20, 104–112 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

de Smet, MD, Gunning, F. & Feenstra, R. El tratamiento quirúrgico de la hipotonía crónica debida a la uveítis. Ojo 19, 60–64 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Tran, VT, Mermoud, A. & Herbort, CP Evaluación y manejo de hipotonía ocular y glaucoma asociado con uveítis. En t. Oftalmol. clin. 40, 175–203 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fan, BJ & Wiggs, JL Glaucoma: Genes, fenotipos y nuevas direcciones para la terapia. J. Clin. Invertir. 120, 3064–3072 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J. et al. Terapia génica para el glaucoma por alteración de la acuaporina 1 del cuerpo ciliar utilizando CRISPR-Cas9. mol. El r. 28, 820–829 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Borrás, T. et al. Mecanismos de transducción de AAV en células de malla trabecular humana asociadas con glaucoma. J. Gen Med. 8, 589–602 (2006).

Artículo PubMed Google Académico

Hedman, K., Watson, PG & Alm, A. El efecto de latanoprost sobre la presión intraocular durante 2 años de tratamiento. sobrev. Oftalmol. 47, S65–76 (2002).

Alm, A., Schoenfelder, J. & McDermott, J. Un estudio de seguridad de 5 años, multicéntrico, abierto, de la terapia adyuvante con latanoprost para el glaucoma. Arco. Oftalmol. 122, 957–965 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bill, A. Fisiología básica del drenaje del humor acuoso. Exp. ojo Res. 25, 291–304 (1977).

Artículo PubMed Google Académico

Sánchez, AR, Rogers, RS & Sheridan, PJ Tetraciclina y otras tinciones con derivados de tetraciclina de los dientes y la cavidad bucal. En t. J. Dermatol. 43, 709–715 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Olimpio, FS et al. Evaluación de microbiota y alteraciones de peso tras la administración de tetraciclina y Lactobacillus gasseri en ratas. actual Microbiol. 77, 2449–2455 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nomura, Y., Zhou, L., Miu, A. y Yokobayashi, Y. Control de la expresión génica de mamíferos mediante ribozimas del virus de la hepatitis alostérica delta. Sintetizador ACS. Biol. 2, 684–689 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Breaker, RR Riboswitches y control de traslación. Harb de primavera fría. Perspectiva. Biol. 10, a032797 (2018).

Tickner, ZJ & Farzan, M. Riboswitches para la expresión controlada de transgenes terapéuticos administrados por vectores virales adenoasociados. Productos farmacéuticos.14, 1–29 (2021).

Artículo Google Académico

Pu, Q. et al. Selección intracelular de aptazima de cabeza de martillo sensible a la teofilina. mol. El r. - Ácidos nucleicos 20, 400–408 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cankaya, AB, Teberik, P. & Acaroglu, G. Alteraciones en la profundidad de la cámara anterior en pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto durante el tratamiento con latanoprost. Acta Oftalmol. 89, 274–277 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Gutiérrez-Ortiz, C., Teus, MA & Bolivar, G. Efectos a corto plazo de latanoprost sobre la profundidad de la cámara anterior en pacientes con glaucoma o hipertensión ocular. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 47, 4856–4859 (2006).

Artículo Google Académico

Scruggs, J., Wallace, T. & Hanna, C. Ruta de absorción del fármaco y la pomada después de la aplicación en el ojo. Ana. Oftalmol. 10, 267–271 (1978).

CAS PubMed Google Académico

Prausnitz, M. & Noonan, J. Permeabilidad de la córnea, la esclerótica y la conjuntiva: un análisis de la literatura para la administración de fármacos al ojo. J. Pharm. ciencia 87, 1479–1488 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Farkouh, A., Frigo, P. y Czejka, M. Efectos secundarios sistémicos de las gotas para los ojos: una perspectiva farmacocinética. clin. Oftalmol. 10, 2433–2441 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kothuri , MK , Pinnamaneni , S. , Das , NG & Das , SA Sistemas de suministro de fármacos oftálmicos 2.ª ed. (Marcel Dekker, Nueva York, 2003).

Olsen, T. Cálculo del poder de la lente intraocular: una revisión. Acta Oftalmol. Escanear. 85, 472–485 (2007).

Artículo PubMed Google Académico

Ning, X., Yang, Y., Yan, H. y Zhang, J. Profundidad de la cámara anterior: un predictor de los resultados refractivos después de la cirugía de cataratas relacionada con la edad. BMC Oftalmol. 19, 1–9 (2019).

Artículo Google Académico

Yu-Wai-Man, P. et al. Mejora visual bilateral con inyección de terapia génica unilateral para la neuropatía óptica hereditaria de Leber. ciencia Traducir Medicina. 12, 24 (2020).

Artículo Google Académico

Nissirios, N. et al. Comparación de las estructuras del segmento anterior en dos modelos de glaucoma de rata: un estudio biomicroscópico de ultrasonido. Invertir. Oftalmol. Vis. ciencia 49, 2478–2482 (2008).

Artículo PubMed Google Académico

Potter, M. et al. Un protocolo de purificación simplificado para vectores de virus recombinantes adenoasociados. mol. El r. - Métodos Clin. desarrollo 1, 14034 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Reid, CA & Lipinski, DM Producción y purificación de virus adenoasociados recombinantes a pequeña y microescala para aplicaciones de terapia génica ocular. Métodos Mol. Biol. 1715, 19–31 (2018).

Piedra, J. et al. Desarrollo de un método rápido, sólido y universal basado en PicoGreen para titular vectores adenoasociados. Tararear. Gene Ther. Métodos 26, 35–42 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Los autores desean agradecer a Clive Wells y Robert Goodwin del núcleo de microscopía electrónica del Medical College of Wisconsin y a Christine Duris y al equipo del núcleo de histología del Children's Research Institute por su ayuda en el procesamiento y la obtención de imágenes del tejido. Los autores también quisieran agradecer a Amira Pavlovich por su ayuda en el registro de la PIO. Los autores también agradecen a Ryan Conrardy, bioestadístico del Medical College of Wisconsin, por su aporte en el análisis de datos. También nos gustaría agradecer a la Dra. Elena V. Semina y al Dr. Michael J. Dunn por asegurar los fondos que ayudaron a respaldar esta investigación (Número de premio del National Eye Institute T32EY014537-EVS, National Eye Institute- R01EY032478 y National Center for Research Resources of el Programa de mejora de las instalaciones de investigación de los NIH - C06RR016511-MJD).

Departamento de Biología Celular, Neurobiología y Anatomía, Facultad de Medicina de Wisconsin, Milwaukee, WI, EE. UU.

Kristina J. Chern, Christopher A. Reid y Daniel M. Lipinski

Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales, Facultad de Medicina de Wisconsin, Milwaukee, WI, EE. UU.

Kristina J. Chern, Emily R. Nettesheim, Christopher A. Reid, Nathan W. Li, Gavin J. Marcoe y Daniel M. Lipinski

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Conceptualización: DML y CAR Metodología: DML, CAR, ERN y KJC Investigación: CAR, ERN, KJC, NWL y GJM Redacción (borrador original): KJC y DML Redacción (revisión y edición): KJC, CAR, ERN, DML , y GJM Supervisión: DML Financiamiento adquisición: DML

Correspondencia a Daniel M. Lipinski.

Los autores declaran los siguientes intereses: DML y CAR tienen una patente que cubre el transgen utilizado (CCPP) en este trabajo. ERN, KJC, NWL y GJM no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Communications Biology agradece a Mathias Seeliger y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Chiea Chuen Khor y Eve Rogers.

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Reimpresiones y permisos

Chern, KJ, Nettesheim, ER, Reid, CA y col. Terapia génica de glaucoma mediada por rAAV basada en prostaglandinas en ratas Brown Norway. Commun Biol 5, 1169 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04134-w

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Recibido: 17 enero 2022

Aceptado: 19 de octubre de 2022

Publicado: 03 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04134-w

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