El mapeo de los antígenos del norovirus humano durante la infección revela la amplitud de la respuesta inmune humoral

npj Vacunas volumen 8, Número de artículo: 87 (2023) Citar este artículo

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Los norovirus humanos (HuNoV) son la principal causa de gastroenteritis aguda en todo el mundo. La respuesta inmunitaria humoral desempeña un papel importante en la eliminación de las infecciones por HuNoV y aclarar el panorama antigénico de HuNoV durante una infección puede arrojar luz sobre los objetivos de los anticuerpos para informar el diseño de la vacuna. Aquí, utilizamos la visualización de fagos asistida por Jun-Fos de una biblioteca genómica del genogrupo GI.1 de HuNoV y la secuenciación profunda para mapear simultáneamente los epítopos de los anticuerpos séricos de seis personas infectadas con GI.1 HuNoV. Encontramos epítopos únicos y comunes que estaban ampliamente distribuidos entre las proteínas no estructurales y la principal proteína de la cápside. Los perfiles de epítopos recurrentes sugieren huellas de anticuerpos inmunodominantes entre estos individuos. El análisis de sueros recolectados longitudinalmente de tres individuos mostró la presencia de epítopos existentes en los sueros previos a la infección, lo que sugiere que estos individuos tenían infecciones previas por HuNoV. No obstante, aparecieron epítopos recién reconocidos siete días después de la infección. Estas nuevas señales de epítopos persistieron 180 días después de la infección junto con los epítopos previos a la infección, lo que sugiere una producción persistente de anticuerpos que reconocen epítopos de infecciones anteriores y nuevas. Por último, el análisis de una biblioteca de presentación de fagos genómicos del genotipo GII.4 con sueros de tres personas infectadas con el virus GII.4 reveló epítopos que se superponían con los identificados en las selecciones de afinidad GI.1, lo que sugiere la presencia de cruces GI.1/GII.4. -anticuerpos reactivos. Los resultados demuestran que la visualización de fagos genómicos junto con la secuenciación profunda puede caracterizar paisajes antigénicos de HuNoV de sueros humanos policlonales complejos para revelar el momento y la amplitud de la respuesta inmune humoral humana a la infección.

Los norovirus humanos (HuNoV) son la principal causa de casos esporádicos y brotes epidémicos de gastroenteritis, provocando ~200 000 muertes y representando una carga económica mundial de 60 000 millones de USD cada año1,2,3. Los norovirus (NoVs) pertenecen a la familia Caliciviridae y se clasifican en 10 genogrupos (GI-GX) y 49 genotipos. Cinco genogrupos de NoV (I, II, IV, VIII y IX), que contienen 38 genotipos diferentes, son capaces de infectar a humanos4. La amplia diversidad de secuencias de HuNoV conduce a un escape inmunitario, creando un obstáculo potencial en el desarrollo de una vacuna ampliamente protectora.

El genoma de NoV es un ARN monocatenario de sentido positivo que tiene una longitud aproximada de 7,5 kilobases (kb) y está organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORF). ORF1 codifica una poliproteína grande que se procesa en seis proteínas no estructurales involucradas en la replicación viral, incluidas NS1/2 (p48), NS3 (nucleósido-trifosfatasa o NTPasa), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (proteasa) y NS7 (ARN polimerasa dependiente de ARN o RdRp). ORF2 y ORF3 codifican las proteínas de la cápside principal (VP1) y secundaria (VP2), respectivamente. La principal proteína de la cápside VP1 se compone de un brazo N-terminal corto, un dominio de cubierta (S) y un dominio sobresaliente (P). El dominio S mantiene la integridad del ensamblaje de la cápside de NoV. El dominio P se une directamente a los antígenos del grupo histo-sanguíneo (HBGA) para infectar células humanas5,6. El dominio P se divide además en los subdominios P1 y P2, donde el subdominio P2 está expuesto en la superficie exterior y tiene una secuencia muy variable, lo que facilita el escape de una respuesta de anticuerpos7. La proteína menor de la cápside VP2 se une a un motivo conservado en el dominio S de VP1. Su función sigue sin estar clara, aunque interactúa con el ARN genómico viral en el NoV8 murino.

La respuesta inmune humoral contra las infecciones por HuNoV juega un papel fundamental en la eliminación viral y la protección contra infecciones posteriores6. La evidencia sugiere que la inmunidad humoral es más efectiva y duradera que la inmunidad de células T en la eliminación de infecciones por HuNoV9. Se han identificado muchos epítopos de anticuerpos monoclonales (mAb) para HuNoV. Una revisión reciente resumió más de 70 estudios publicados que delinean epítopos lineales y conformacionales, en su mayoría residentes en VP1, para 307 mAb9 únicos. Aunque el mapeo de epítopos en mAbs es fundamental para el diseño racional de vacunas, no puede capturar la totalidad de la respuesta inmune humoral policlonal. Para obtener una comprensión integral de la inmunidad humoral contra las infecciones por norovirus, se necesita la identificación de epítopos en sueros humanos policlonales. El trabajo anterior evaluó sueros humanos policlonales de individuos infectados con HuNoV y participantes de ensayos de vacunas y determinó la presencia de inmunidad protectora y anticuerpos de bloqueo de reacción cruzada en esas dos cohortes10,11,12,13,14,15. Los anticuerpos séricos bloqueadores de HBGA aumentan después del desafío con HuNoV y las infecciones naturales10,11,12,14. Otro estudio examinó el repertorio serológico de sueros pre y posinmunizados de tres participantes en un ensayo de vacuna bivalente e identificó un anticuerpo neutralizante ampliamente protector y su epítopo de reacción cruzada15. Sin embargo, el panorama antigénico completo de HuNoV sigue siendo incompleto. Un mapa completo de los epítopos de HuNoV proporcionaría una visión sistemática de la respuesta inmunitaria humoral durante la infección por HuNoV. Dichos mapas podrían abordar preguntas como qué epítopos se reconocen durante una infección por HuNoV, si el panorama antigénico de HuNoV difiere de persona a persona, si el panorama cambia a medida que avanza la infección y si hay epítopos conservados e inmunodominantes entre los HuNoV.

La exhibición de fagos implica la presentación de péptidos o proteínas en la superficie de la cápside del bacteriófago16. Los péptidos o proteínas mostrados están codificados dentro del genoma de cada partícula de fago. Por lo tanto, se pueden seleccionar grandes bibliotecas de péptidos para determinar la unión a proteínas diana mediante selección por afinidad y secuenciación de ADN17,18,19,20,21. Al mapear los epítopos de los anticuerpos provocados por la infección, la visualización de fagos junto con la secuenciación de próxima generación (NGS) puede proporcionar una vista de alta resolución del paisaje de epítopos durante la respuesta inmune humoral. Recientemente, tecnologías como VirScan, que utiliza una biblioteca de péptidos de 206 especies de virus que se muestran en una plataforma de fagos T7 junto con NGS, así como una biblioteca de visualización de fagos de pan-coronavirus, se han utilizado para perfilar respuestas inmunitarias en sueros de pacientes con COVID. para investigar las respuestas inmunes frente al SARS-CoV-222,23,24.

Anteriormente, realizamos selecciones de afinidad de visualización de fagos de una biblioteca de visualización de fagos genómicos de HuNoV junto con secuenciación profunda para identificar epítopos de un anticuerpo scFv y sueros de conejo policlonales contra HuNoV25 (Fig. S1). En este nuevo estudio, nuestro objetivo fue caracterizar el repertorio de la respuesta inmune humoral contra las infecciones por HuNoV mediante la realización de selecciones de afinidad junto con una secuenciación profunda en sueros humanos de individuos infectados con HuNoV. Utilizando nuestra biblioteca de visualización de fagos genómicos GI.1 Norwalk y una biblioteca de visualización de fagos genómicos GII.4 HOV recién construida, perfilamos nueve sueros humanos policlonales en un único momento después de la infección. Además, realizamos un estudio longitudinal en sueros de tres personas tanto antes de la infección como en múltiples puntos después de la infección. Identificamos epítopos en las proteínas no estructurales NS1/2 (p48), NS3 (NTPasa), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (proteasa) y NS7 (RdRp), así como epítopos de reacción cruzada en la proteína principal VP1. proteína de la cápside exclusiva de GI.1 Norwalk o GII.4 HOV. Observamos que los paisajes antigénicos varían entre individuos, pero también contienen epítopos recurrentes comunes. También determinamos los cambios en los perfiles de epítopos en individuos durante el curso de la infección. Estos estudios revelaron la presencia de epítopos en los sueros previos a la infección, lo que indica que los individuos tenían infecciones previas por HuNoV. Surgieron nuevos epítopos en proteínas estructurales y no estructurales de 7 a 30 días después de la infección. La mayoría de estos epítopos, junto con los epítopos detectados en los sueros previos a la infección, persistieron 180 días después de la infección. Por último, detectamos epítopos comunes a GI.1 Norwalk y GII.4 HOV, lo que confirma la presencia de anticuerpos con reacción cruzada entre genogrupos. Nuestros resultados muestran que la visualización de fagos junto con la secuenciación profunda puede caracterizar con éxito los epítopos en sueros humanos policlonales complejos, proporcionando una comprensión más profunda de la respuesta inmunitaria de HuNoV, lo que puede ayudar al desarrollo de métodos de detección de infecciones por HuNoV y una vacuna ampliamente protectora.

Anteriormente, construimos una biblioteca de presentación de fagos genómicos cortados GI.1 y la utilizamos para mapear el epítopo de un anticuerpo25 scFV humano (Fig. S1). La biblioteca también se usó para mapear simultáneamente múltiples epítopos de antisueros policlonales de conejo generados contra partículas similares a virus (VLP) GI.125. Se agruparon más de 450 000 clones para crear esta biblioteca genómica GI.1, que NGS demostró que era muy diversa con inserciones que mostraban una excelente cobertura de los marcos de lectura abiertos GI.125.

En este estudio, nuevamente utilizamos la biblioteca GI.1 para mapear el panorama antigénico para la infección por HuNoV. Verificamos la diversidad de inserciones en la biblioteca repitiendo NGS de la región de inserción de la biblioteca ingenua, lo que confirma la alta diversidad de la biblioteca (Fig. 1a, b). La clonación de ADN cizallado en el plásmido de presentación de fagos da como resultado insertos en la orientación directa o inversa con respecto al genoma GI.1. Tenga en cuenta que solo las inserciones de orientación hacia adelante codificarán péptidos HuNoV en marco. Contamos un total de siete millones de inserciones de cadena directa y nueve millones de inserciones de cadena inversa presentes en la biblioteca. Los insertos se alinearon con el genoma de referencia para obtener una puntuación de cobertura por nucleótido26,27. La puntuación de cobertura se calculó como el número de apariciones de cada posición de nucleótido en el grupo de inserciones tanto directas como inversas alineadas con el genoma de referencia (Fig. 1c)28. Los resultados mostraron que tanto para las cadenas directas como las inversas, hay múltiples insertos para cada posición de nucleótido en el plásmido que contiene el genoma de HuNoV, lo que indica además una excelente cobertura del genoma por insertos (Fig. 1c). También se calculó la distribución de tamaños de los insertos, lo que muestra que los insertos codifican péptidos que varían de 10 a 170 aminoácidos de longitud, con el inserto promedio que codifica 47 aminoácidos (Fig. 1d). La amplia gama de longitudes de péptidos, así como su distribución continua, sugiere que tanto los epítopos lineales como los conformacionales están codificados por insertos en la biblioteca.

a Distribución de los insertos de cadena directa (rojo) en la biblioteca ingenua asignada a sus posiciones en el plásmido pKS-NV68 KM. La posición del extremo 5' del inserto en el plásmido pKS-NV68 KM se muestra en el eje x, mientras que la posición del extremo 3' del inserto se designa en el eje y. El número de ocurrencias de la inserción se define como conteos en el eje z. b Distribución de inserciones de cadena inversa (negro) en la biblioteca ingenua. c Cobertura de la biblioteca ingenua definida por alineaciones de secuencias de ADN. Se alinearon un total de 7.498.441 inserciones de cadena directa y 9.481.435 inserciones de cadena inversa para generar una puntuación de cobertura por posición de nucleótido. La puntuación de cobertura se definió como el número de apariciones de cada posición de nucleótido en el conjunto de fragmentos de inserción de ADN alineados para las inserciones de cadena directa y las inserciones de cadena inversa, respectivamente. Las puntuaciones de cobertura para los insertos de cadena directa de pKS-NV68 KM (rojo) se muestran sobre el eje x, mientras que las puntuaciones de cobertura para los insertos de cadena inversa (gris) se muestran debajo del eje x. d Distribución del tamaño del péptido en la biblioteca ingenua. La frecuencia de cada péptido único se muestra en el eje y, mientras que el tamaño del péptido se muestra en el eje x.

Para perfilar la respuesta de anticuerpos contra los HuNoV durante la infección, se usaron muestras de suero de personas infectadas con GI.1 para la selección por afinidad de la biblioteca de presentación de fagos genómicos de GI.1. Examinamos sueros de seis personas que estaban infectadas con GI.1 HuNoV. Estos sueros fueron recolectados como parte de un estudio previo29,30. Las selecciones de afinidad se realizaron en sueros de cuatro personas 14 días después de la infección y dos personas 30 días después de la infección. Las selecciones de afinidad se realizaron inmovilizando primero los anticuerpos en los sueros utilizando perlas magnéticas de proteína A/G. La biblioteca de fagos vírgenes se añadió a los anticuerpos inmovilizados para permitir la unión. Después de dos rondas de selección por afinidad, los fagos unidos se eluyeron y la región del inserto se amplificó por PCR. Se realizó una secuenciación profunda en los productos de la PCR para evaluar la distribución de los insertos cuando se alinearon con la secuencia del plásmido que incluye los ORF de HuNoV (Fig. 1). Los resultados para el individuo 715 se muestran en la Fig. 2 y los resultados para los seis individuos se muestran en la Fig. S2.

El eje x indica el extremo 5′ de las inserciones, el eje y el extremo 3′ de las inserciones y el eje z el número de ocurrencias. La distribución de los grupos de inserción define los epítopos anti-GI.1 en a NS1/2 (p48), b NS3 (NTPasa), c NS4 (p22), d NS5 (VPg), e NS6 (proteasa) y f NS7 ( RdRp).

Los epítopos se identificaron a partir de los datos de secuenciación profunda basados ​​en la distribución de insertos expresados ​​como números de conteo asignados al genoma de HuNoV con la premisa de que los números de conteo son proporcionales al grado de enriquecimiento de anticuerpos en los sueros25,27. La distribución de insertos y puntajes de cobertura asociados después de dos rondas de selección por afinidad con sueros de individuos infectados mostró una amplia gama de señales que representan epítopos ubicados en la proteína de la cápside VP1, así como en varias proteínas no estructurales (Fig. S2).

La biblioteca de presentación de fagos genómicos se construyó ligando ADN genómico cizallado al azar en el plásmido de presentación de fagos. Debido a que las inserciones genómicas pueden estar en cualquier orientación (hacia adelante o hacia atrás) y cualquiera de los tres marcos de lectura, la mayoría de las inserciones en la biblioteca ingenua están fuera de marco y no producirán un péptido HuNoV. Si la selección por afinidad es enriquecedora para los péptidos HuNoV reconocidos por los anticuerpos en los sueros, la frecuencia de insertos que codifican péptidos en marco debe aumentar con rondas de selección posteriores, mientras que los insertos que codifican secuencias fuera de marco deben eliminarse. Como se ve en la Fig. S3a, aproximadamente el 20 % de las inserciones en la biblioteca ingenua codifican péptidos en marco, como se esperaba para las inserciones aleatorias, mientras que en la ronda 2 de selección, se encontró que entre el 70 y el 90 % de las inserciones codifican en marco los péptidos mientras que los insertos que codificaban secuencias fuera de marco se eliminaron en gran medida. Estos resultados indican que la selección por afinidad enriqueció las secuencias de HuNoV que se unen a los anticuerpos presentes en los sueros, es decir, los epítopos. También analizamos la fracción de inserciones en el marco para cada número de conteo. La figura S3b muestra que la fracción de inserciones en marco en la biblioteca ingenua para cada grupo de conteo de inserciones se mantuvo consistentemente en 20 %, que es lo mismo que observamos para la fracción total de inserciones en marco. Además, observamos que la frecuencia de inserciones en marco en las bibliotecas después de la selección comienza a aumentar con inserciones con un conteo de cinco. Esto sugiere que las inserciones en marco que tienen un recuento de cinco o más codifican péptidos enriquecidos por selección por afinidad, es decir, epítopos. Por lo tanto, se eligieron insertos en marco con un recuento de cinco o más en las bibliotecas después de la selección para calcular las puntuaciones de cobertura por posición de nucleótido, como se describe anteriormente para la biblioteca ingenua.

Para ilustrar la profundidad de la secuenciación y cómo las secuencias que componen cada epítopo se enriquecen repetidamente con los anticuerpos en los sueros, el mapa de cobertura para el participante del estudio 715 se muestra como ejemplo en las Figs. 3 y S4. El mapa de cobertura indica que los epítopos en ORF1 están ubicados como secuencias de aminoácidos en marco en NS1/2 (p48), NS3 (NTPasa), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (proteasa) y NS7 (ARN -polimerasa de ARN dependiente, o RdRp). El mapa de cobertura también indica la presencia de epítopos en la proteína de la cápside VP1 (no marcada en las Figs. 3 y S4). Los epítopos revelados por las puntuaciones de cobertura se pueden resolver a una resolución más alta al alinear las secuencias asociadas con las regiones de puntuaciones de cobertura altas para definir con precisión los epítopos con una resolución de un solo aminoácido (Figs. 3 y S4). Por ejemplo, la alineación de las secuencias asociadas con NS4 reveló un epítopo de 100 aminoácidos. Dado que los epítopos lineales tienen menos de 20 aminoácidos de longitud31, es probable que el epítopo NS4 sea conformacional (Figs. 3, S4, Tabla S1). Las alineaciones de secuencias de regiones de alta puntuación de cobertura de este individuo proporcionaron de manera similar una definición de alta resolución de otros epítopos como se ve en la Fig. 3 y la Tabla S1. En conjunto, estos resultados muestran que la selección por afinidad y el enfoque de secuenciación profunda pueden identificar múltiples epítopos simultáneamente y con alta resolución a partir de una sola muestra de suero policlonal.

La cobertura de los insertos después de dos rondas de selección por afinidad con sueros del sujeto 715 se determinó mediante el alineamiento de la secuencia de ADN con el plásmido que contenía los ORF GI.1 y se muestra a la izquierda. La puntuación de cobertura por nucleótido se muestra en el eje y, mientras que la posición en la secuencia del plásmido se muestra en el eje x. Las posiciones de los ORF 1 a 3 de HuNoV se muestran debajo del eje x como referencia. Solo se muestran los insertos de la cadena anterior. La alineación de péptidos enriquecidos en NS6 (proteasa) se muestra a la derecha. La numeración en la parte superior de la alineación indica las posiciones de los residuos de aminoácidos en las proteínas no estructurales. Se utiliza el esquema de color de Jalview Zappo, en el que los residuos alifáticos/hidrofóbicos (I, L, V, A y M) son melocotón, los residuos aromáticos (F, W e Y) son oro, los residuos cargados positivamente (K, R, y H) son azules, los residuos cargados negativamente (D y E) son rojos, los residuos hidrófilos (S, T, N y Q) son verdes, los residuos conformacionalmente especiales (G y P) son magenta y la cisteína es amarilla. Las familias de péptidos alineadas de izquierda a derecha en el mapa de cobertura definen los epítopos anti-GI.1 en NS1/2 (p48), NS3 (NTPasa), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (proteasa) y NS7 (RdRp).

Luego comparamos la distribución de epítopos para anticuerpos provocados por la infección por HuNoV entre los diferentes individuos. Esto se logró comparando los mapas de puntuación de cobertura para detectar los epítopos únicos y compartidos entre la cohorte de seis individuos. Los epítopos se verificaron aún más comparando la fracción de las inserciones en el marco en una ventana que contiene un epítopo potencial con la fracción de las inserciones en el marco en la biblioteca ingenua. Si la frecuencia de inserción en el marco de las bibliotecas después de la selección por afinidad es mayor que la de la biblioteca ingenua en una ventana dada, se confirma la presencia de un epítopo (Fig. 4).

a La cobertura de los insertos en la biblioteca ingenua (arriba), así como los insertos después de dos rondas de selección por afinidad con sueros de los sujetos 715, 720, 723, 731, 732 y 750, se determinó mediante el alineamiento de la secuencia de ADN con el plásmido que contiene GI.1 ORF. La puntuación de cobertura por nucleótido se muestra en el eje y, mientras que la posición en la secuencia del plásmido se muestra en el eje x. Las posiciones de los ORF 1 a 3 de HuNoV se muestran debajo del eje x como referencia. Solo se muestran los insertos de la cadena anterior. b La fracción de inserciones en marco en ORF2 en la biblioteca ingenua versus inserciones en marco después de dos rondas de selección por afinidad con sueros de los sujetos 715, 720, 723, 731, 732 y 750. Una ventana deslizante de ocho aminoácidos a lo largo del GI .1 ORF2 se muestra en el eje x, mientras que la fracción de las inserciones en el marco de la biblioteca ingenua (barras negras) y las bibliotecas después de dos rondas de selección por afinidad (barras rojas) se muestran en el eje y.

Identificamos 13 epítopos en las proteínas no estructurales. Hay tres epítopos prominentes en NS1/2 que se encuentran en múltiples individuos. Las alineaciones indican que los epítopos se asignan a las posiciones de aminoácidos 131–190, 248–282 y 315–355 de ORF1, y se encontraron en uno, dos y un individuo, respectivamente (Figs. 4a, 5, Tabla S1). Otros 3 epítopos prominentes están en NS3, ubicados en las posiciones 406–448, 498–554, cada uno encontrado en un individuo, y 697–743, encontrado en dos individuos. El séptimo epítopo tiene una longitud de 100 aminoácidos y cubre las posiciones 759–858 de ORF1 en el dominio N-terminal (NTD) de NS4. Como se señaló, la longitud de esta secuencia sugiere que es un epítopo conformacional. Este epítopo se encontró en cinco individuos. El octavo epítopo está en NS5 en las posiciones 987–1037 y se encontró en los seis individuos. El noveno epítopo está en NS6. Este epítopo, encontrado en cinco individuos, abarca 86 residuos desde las posiciones 1095 a 1180. Se identificaron cuatro epítopos en NS7 y están ubicados en las posiciones 1311–1353, 1488–1539, 1577–1653 y 1709–1780 de ORF1 con longitudes de 43 , 52, 77 y 72 aminoácidos, respectivamente. Los dos primeros epítopos de NS7 se encontraron en dos individuos, mientras que el tercer epítopo se encontró en un individuo y el último epítopo se encontró en cuatro individuos (Figs. 4a, 5, Tabla S1). La longitud de las secuencias sugiere que son epítopos conformacionales.

El dendrograma compara los perfiles de epítopos compartidos entre los seis individuos. Los bloques rosas indican epítopos para cada individuo en el dominio de proteína estructural o no estructural especificado.

Para identificar epítopos en VP1, dividimos ORF2 en 67 ventanas que tienen 24 nucleótidos u ocho residuos de aminoácidos de largo. De manera similar a cómo definimos los epítopos en ORF1, comparamos las frecuencias de las inserciones en el marco en las bibliotecas después de la selección y en la biblioteca ingenua. Si la frecuencia de las inserciones en el marco de las bibliotecas seleccionadas es mayor que la de la biblioteca ingenua en una ventana de 8 mer determinada, alineamos las inserciones dentro de la ventana para identificar un epítopo. En general, identificamos 35 epítopos en VP1 con 19 en el dominio S, 12 en el subdominio P1 y cuatro en el subdominio P2. De manera similar a los epítopos que encontramos en las proteínas no estructurales, la mayoría de los epítopos de VP1 se compartieron entre más de dos individuos, con cinco epítopos presentes en los seis individuos, lo que sugiere que estos epítopos son altamente inmunogénicos (Figs. 4b, 5, Tabla S1).

Hay 19 epítopos en el dominio S, cuya longitud oscila entre 12 y 35 residuos. También mapeamos tres epítopos que fueron reconocidos por el anticuerpo HJT-R3-A9 scFv. Según la longitud, la mayoría de estas secuencias parecen ser epítopos lineales. Identificamos 16 epítopos en el dominio P, con una longitud de 8 a 38 residuos. La mayoría de estas secuencias tienen menos de 20 residuos, lo que sugiere que son epítopos lineales (Figs. 4b, 5, Tabla S1).

Aunque la mayoría de los epítopos se encontraron en al menos dos individuos, la constelación de epítopos en cada individuo es única. Es decir, no hay dos individuos que tengan exactamente el mismo conjunto de epítopos. Estos resultados se visualizan mejor en un dendrograma que muestra similitudes entre individuos entre los conjuntos de epítopos reconocidos (Fig. 5). Por ejemplo, el dendrograma muestra que los individuos 731, 750 y 732 tienen un conjunto de epítopos muy similar y, por lo tanto, una respuesta de anticuerpos similar, mientras que los individuos 720 y 750 tienen una respuesta de anticuerpos más divergente a la infección. También es interesante señalar que se observaron más epítopos en VP1 para los individuos 731 y 732, cuyos sueros se recolectaron 30 días después de la infección, en comparación con los otros tres individuos (715, 720 y 723) cuyos sueros se recolectaron en 14 días post infección (Figs. 4, 5).

Tomados en conjunto, los resultados mostraron que el paisaje antigénico incluye todas las proteínas estructurales y no estructurales, con cada persona que contiene anticuerpos en sus sueros policlonales para una colección única de epítopos lineales y conformacionales que, sin embargo, son ampliamente compartidos entre el conjunto de individuos.

Estudios previos han estimado que la inmunidad protectora contra las infecciones por HuNoV oscila entre 4,1 y 8,7 años32,33,34. Sin embargo, el panorama antigénico asociado con la inmunidad humoral a lo largo de una infección no está claro. Por lo tanto, realizamos un estudio longitudinal del panorama de epítopos asociado con la respuesta de anticuerpos en el transcurso de las infecciones por HuNoV en múltiples individuos. Para este propósito, examinamos sueros recolectados durante un lapso de 180 días, incluidos cinco puntos de tiempo diferentes para los sujetos de estudio 731, 732 y 750. Los cinco puntos de tiempo incluyeron antes de la infección, 7, 14, 30 y 180 días después de la infección. La distribución del recuento de insertos y las puntuaciones de cobertura obtenidas después de dos rondas de selección por afinidad para cada punto de tiempo revelaron epítopos a lo largo de los ORF de HuNoV. Para mayor claridad, solo se marcaron los epítopos en las proteínas no estructurales. Cada uno de los participantes del estudio tenía anticuerpos que reconocían epítopos definidos para HuNoV en los sueros previos a la infección, lo que indica que habían sido infectados previamente con HuNoV (Figs. 6, S5). Estos epítopos preexistentes se verificaron confirmando que la fracción de insertos en marco era mayor en las bibliotecas seleccionadas que en la biblioteca ingenua. Todos los epítopos identificados en el individuo 731 eran preexistentes y la mayoría de ellos persistió durante todo el curso de la infección. Hubo tres epítopos que surgieron después de la infección en el sujeto 732, que son los primeros epítopos en NS1/2, NS5 y NS6, y un epítopo que apareció después de la infección en el sujeto 750, que es el primer epítopo en NS7 (Figs. 6, S5). El resto de los epítopos en los sujetos 732 y 750 eran preexistentes.

La cobertura de los insertos después de dos rondas de selección por afinidad con sueros recolectados en diferentes momentos de los sujetos 731, 732 y 750 se determinó mediante la alineación de la secuencia de ADN con el plásmido que contenía los ORF GI.1. La puntuación de cobertura por nucleótido se muestra en el eje y, mientras que la posición en la secuencia del plásmido se muestra en el eje x. Las posiciones de los ORF 1 a 3 de HuNoV se muestran debajo del eje x como referencia. Solo se muestran los insertos de la cadena anterior. a La cobertura de insertos después de dos rondas de selección por afinidad con 731 sueros del sujeto antes del desafío y 7, 14, 30 y 180 días después del desafío. b La cobertura de insertos después de dos rondas de selección por afinidad con 732 sueros del sujeto antes del desafío y 7, 14, 30 y 180 días después del desafío. c La cobertura de insertos después de dos rondas de selección por afinidad con sujetos 750 sueros antes del desafío y 7, 14, 30 y 180 días después del desafío. Las líneas punteadas representan epítopos preexistentes que persisten desde los sueros previos a la infección hasta 180 días después de la infección, mientras que las líneas continuas representan epítopos que emergen después de la infección.

Entre los epítopos que surgieron después de la infección, el epítopo en NS5 mostró un mayor enriquecimiento para los tres individuos y alcanzó los puntajes de cobertura más altos a los 14 y 30 días para los sujetos 731 y 750 y a los 14 días para el sujeto 732. Los epítopos en NS4 y NS6 para el sujeto 732 también mostró un mayor enriquecimiento a los 14 días hasta los 180 días posteriores a la infección. Esto indica que se indujeron respuestas inmunitarias dirigidas a combinaciones de los epítopos en NS4, NS5 y NS6 al comienzo de la infección para diferentes individuos. Finalmente, 180 días después de la infección, los recuentos de inserciones y las puntuaciones de cobertura han vuelto al panorama de epítopos de referencia observado antes del desafío con HuNoV para la mayoría de los epítopos. Específicamente, los anticuerpos que se indujeron después de la infección como parte de la respuesta adaptativa también permanecieron en el día 180 (es decir, NS4 y NS6 para el sujeto 732). En general, estos resultados muestran que el panorama de epítopos difiere entre individuos y que los anticuerpos presentes durante una infección por HuNoV son una combinación de anticuerpos preexistentes que presumiblemente surgen de una infección anterior, así como nuevos anticuerpos inducidos por el desafío de HuNoV. Es de destacar que estos anticuerpos persistentes preexistentes aparentemente no proporcionaron protección contra la infección en el sentido de que todos estos individuos se infectaron en presencia de los anticuerpos.

Los norovirus son genéticamente diversos y se clasifican en 10 genogrupos diferentes según su identidad de secuencia y se subdividen en 49 genotipos4. Idealmente, una vacuna contra el norovirus estaría dirigida a los epítopos conservados en genogrupos y genotipos. GII.4 Los HuNoV han sido responsables de la mayoría de los brotes en los últimos 15 años en todo el mundo35,36,37. También inducen síntomas más severos que requieren atención médica intensa en los niños38. Para comprender más acerca de la reactividad cruzada de la respuesta inmune contra los HuNoV, así como el panorama antigénico del norovirus GII.4, generamos una biblioteca de visualización de fagos genómicos cortados GII.4 HOV, utilizando los mismos métodos que se describen para el GI.1 biblioteca. La secuenciación profunda de la biblioteca ingenua GII.4 HOV reveló una distribución densa de las inserciones directas e inversas a lo largo de la secuencia del plásmido con los ORF GII.4 HOV (Fig. 7a, b). Se alinearon aproximadamente ocho millones de inserciones directas y cinco millones de inserciones inversas para obtener una puntuación de cobertura de posición por nucleótido (Fig. 7c). Los resultados revelaron una excelente cobertura en cada posición de nucleótido del plásmido que contenía el genoma GII.4 HOV que se utilizó para construir la biblioteca. La distribución de tamaños de péptidos codificados por los insertos oscila entre aproximadamente 10 y 180 aminoácidos con un tamaño medio de 58 aminoácidos (Fig. 7d). Similar a la biblioteca GI.1, la biblioteca GII.4 HOV tenía una distribución continua de tamaños de péptidos, lo que indica que los tamaños de inserción son muy diversos.

a Distribución de los insertos de cadena directa (rojo) en la biblioteca ingenua asignada a sus posiciones en el plásmido que contiene los ORF GII.4 HOV. La posición del extremo 5' del inserto en el plásmido se muestra en el eje x, mientras que la posición del extremo 3' del inserto se designa en el eje y. El número de ocurrencias de la inserción se define como conteos en el eje z. b Distribución de inserciones de cadena inversa (negro) en la biblioteca ingenua. c Cobertura de la biblioteca ingenua definida por alineaciones de secuencias de ADN. Se alinearon un total de 8 364 766 insertos de cadena directa y 5 535 252 insertos de cadena inversa para generar una puntuación de cobertura por posición de nucleótido. La puntuación de cobertura se definió como el número de apariciones de cada posición de nucleótido en el conjunto de fragmentos de inserción de ADN alineados para las inserciones de cadena directa y las inserciones de cadena inversa, respectivamente. Las puntuaciones de cobertura para las inserciones de cadena directa del plásmido (rojo) se muestran sobre el eje x, mientras que las puntuaciones de cobertura para las inserciones de cadena inversa (gris) se muestran debajo del eje x. d Distribución del tamaño del péptido en la biblioteca ingenua. La frecuencia de cada péptido único se muestra en el eje y, mientras que el tamaño del péptido se muestra en el eje x.

Realizamos selecciones de afinidad usando la biblioteca GII.4 HOV contra sueros de tres individuos con niveles elevados de anticuerpos séricos anti-GII.4 Sydney 2012, uno de los cuales (BCM16-1) tenía una infección reciente por el virus GII.4 Sydney 2012. Además, realizamos una selección por afinidad usando la biblioteca GII.4 HOV contra el anticuerpo scFv HJT-R3-A9 y los antisueros de conejo anti-GI.1 VLP, los cuales se unen a GI.1 VP1. Se evaluó la frecuencia de insertos que codifican péptidos HuNoV en marco en la biblioteca ingenua GII.4 HOV y después de cada ronda de selección por afinidad. La Figura S6a muestra que, de manera similar a la progresión de las selecciones por afinidad de las rondas uno a dos usando la biblioteca GI.1, la selección por afinidad se enriqueció con las secuencias de HuNoV que se unen a los anticuerpos séricos. La fracción de inserciones en el marco para cada número de conteo, como se muestra en la Figura S6b, también comenzó a aumentar en las inserciones con un conteo de cinco, aunque no tan evidente como los resultados para GI.1. Los insertos con un recuento de cinco o más se usaron para calcular las puntuaciones de cobertura por posición de nucleótido.

El recuento de insertos y los mapas de cobertura generados después de la secuenciación profunda de las selecciones de la biblioteca GII.4 HOV revelaron epítopos que se encuentran en NS1/2 (p48), NS3 (NTPasa), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (proteasa) , y el NS7 (RdRp) (Figs. 8, S7, Tabla S2). Mapeo de epítopos a NS1/2 de sueros de los tres individuos comparten un epítopo de residuos 68 a 113 de ORF1. El epítopo en NS3 también se compartió con las tres personas y tiene 81 residuos (395–475), lo que sugiere que es un epítopo conformacional. El epítopo en NS4 también apareció en los tres individuos con una secuencia de 78 residuos (702–779). El epítopo en NS5 tiene dos residuos que se superponen al extremo C-terminal de NS4 y apareció en los tres individuos. Este epítopo tiene una secuencia común de 69 residuos (872–942), lo que sugiere que es un epítopo conformacional. Finalmente, el epítopo en NS6 se superpone a NS5 y NS6 también se comparte entre los tres individuos y se ubica desde la posición 982 a la 1029 de ORF1. El último epítopo solo estaba presente en el sujeto BCM16-1 y está en NS7. Este epítopo tiene 64 residuos (1220–1283), lo que nuevamente sugiere un epítopo conformacional (Figs. 8, S7, Tabla S2).

a La cobertura de los insertos en la biblioteca ingenua (arriba), así como los insertos después de dos rondas de selección por afinidad con sueros de sujetos BCM16-1 sueros, BCM13-1 sueros, BCM16-2 sueros, anticuerpos policlonales de conejo anti-NV, y anticuerpo HJT-R3-A9 scFv determinado por alineamiento de la secuencia de ADN con el plásmido que contiene los ORF GII.4 HOV. La puntuación de cobertura por nucleótido se muestra en el eje y, mientras que la posición en el plásmido se muestra en el eje x. Las posiciones de GII.4 HOV ORFs 1 a 3 se muestran debajo del eje x como referencia. Solo se muestran los insertos de la cadena anterior. b La fracción de insertos en marco en ORF2 en la biblioteca ingenua versus insertos en marco después de dos rondas de selección por afinidad con sueros de sujetos BCM16-1, BCM13-1, BCM16-2, anticuerpos policlonales de conejo anti-NV y HJT -R3-A9 scFv anticuerpo en GII.4 HOV ORF2. Una ventana deslizante de ocho aminoácidos a lo largo de GI.1 ORF2 se muestra en el eje x, mientras que la fracción de las inserciones en el marco de la biblioteca ingenua (barras negras) y las bibliotecas después de dos rondas de selección por afinidad (barras rojas) se muestran en el eje y.

La selección por afinidad de la biblioteca GII.4 HOV contra estos objetivos también mostró un enriquecimiento de secuencias de VP1. Al igual que con el experimento GI.1, dividimos ORF2 en 68 ventanas que tienen 24 nucleótidos u ocho residuos de largo, y comparamos la frecuencia de las inserciones en el marco de las bibliotecas seleccionadas y la biblioteca ingenua en cada ventana. Las inserciones en el marco con una frecuencia más alta después de la selección que la de la biblioteca ingenua se alinearon para identificar los epítopos. Identificamos un total de 18 epítopos en VP1 con 10 en el dominio S, cuatro en el subdominio P1 y cuatro en el subdominio P2. Seis individuos tenían un epítopo único. Entre los 30 individuos que tenían más de dos epítopos, cinco epítopos en el NTD del dominio S estaban presentes en los seis individuos, lo que sugiere que estos cinco epítopos son altamente inmunogénicos. (Fig. 8, Tabla S2). Los perfiles de epítopos de los sueros de los tres individuos, así como el anticuerpo A9 y los sueros de conejo anti-NV se muestran en el dendrograma, que muestra que los perfiles inmunitarios entre el anticuerpo A9 y los sueros anti-NV son los más similares mientras que los perfiles entre los sueros están más estrechamente relacionados, y BCM16-1 y BCM16-2 tienen el perfil de epítopo más similar (Fig. S8).

En general, se identificaron menos epítopos usando la biblioteca GII.4 HOV contra los sueros de individuos infectados con GII.4 Sydney que los observados en las selecciones de la biblioteca GI.1 contra los sueros de individuos infectados con GI.1. Esto probablemente se deba al uso de la biblioteca GII.4 HOV contra sueros de personas infectadas con un genotipo GII.4 diferente. Además, los sueros GII.4 procedían de infecciones naturales y la línea de tiempo entre la infección y la recolección de sueros no está clara. Se espera que el momento de la recolección de sueros afecte los epítopos observados.

Dado que los individuos no estaban infectados con GII.4 HOV 2002 y se demostró que el anticuerpo A9 y los sueros de VLP anti-conejo identificaban los epítopos GI.1 y GII.4, los epítopos identificados a partir de la selección por afinidad de la biblioteca GII.4 HOV frente a estos los objetivos serían los anticuerpos de reactividad cruzada que reconocen tanto GI.1 como GII.4. Para identificar epítopos de reacción cruzada y determinar el nivel de conservación de la secuencia dentro de los epítopos, alineamos las secuencias de los epítopos HOV GI.1 y GII.4 (Fig. S9a) y calculamos el porcentaje de identidad (PI) entre el GI.1 y GII.4 secuencias de epítopos HOV. Las alineaciones revelaron que el epítopo NS7 tiene el valor de IP más alto, 81,4 %, entre todos los epítopos (Fig. S9a), lo que indica que este epítopo es el más conservado entre los genogrupos. El epítopo con el valor de PI más bajo (27,5%) es el de NS1/2. Dentro de VP1, el epítopo con el valor de PI más alto (79,5 %) está en el dominio S, o el undécimo epítopo en la Fig. S9a. El epítopo con el valor de PI más bajo (31,6 %) está en el NTD del dominio S, o el 7.° epítopo en S9a. Los altos niveles de conservación de la mayoría de los epítopos de reacción cruzada en las proteínas estructurales y no estructurales sugieren una posible integración en una vacuna protectora amplia si muestran propiedades de bloqueo de HBGA. Además, podrían encontrar uso como herramientas de diagnóstico ampliamente reactivas para detectar infecciones por norovirus (Fig. S9). Finalmente, buscamos las secuencias de los epítopos de norovirus identificados aquí utilizando la proteína BLAST y no identificamos coincidencias de alta similitud de secuencia con virus distintos de los norovirus. Por lo tanto, los anticuerpos que se unen a los epítopos que identificamos probablemente sean específicos para los norovirus.

En conjunto, los resultados de los sueros postinfección GI.1 y GII.4 HOV, los sueros anti-NV y el anticuerpo scFv HJT-R3-A9 mostraron que las selecciones de afinidad de presentación de fagos junto con la secuenciación profunda se pueden usar en humanos policlonales complejos. sueros para identificar simultáneamente múltiples epítopos. Nuestros datos identificaron 48 epítopos GI.1 y 24 GII.4 HOV en las proteínas estructurales y no estructurales. Se identificaron perfiles de epítopos similares entre los individuos infectados, aunque también estaban presentes epítopos únicos. También observamos que los epítopos cambian a lo largo de las infecciones, lo que ilustra la naturaleza dinámica de la respuesta inmunitaria adaptativa. Por último, observamos anticuerpos que tienen reactividad cruzada entre GI.1 y GII.4 HOV. Los 10 epítopos reconocidos por los anticuerpos de reacción cruzada tienen el potencial de incorporarse a una vacuna o herramienta de diagnóstico para la detección de infecciones por norovirus.

Aquí, demostramos que la visualización de fagos asistida por Jun-Fos junto con la secuenciación profunda puede mapear simultáneamente múltiples epítopos de sueros humanos policlonales complejos. Utilizamos este enfoque con bibliotecas genómicas GI.1 y GII.4 HOV para determinar el paisaje de epítopos para nueve sueros humanos policlonales complejos de individuos infectados con HuNoV y una colección longitudinal de 15 sueros de cinco puntos temporales de tres individuos infectados. Nuestros datos revelaron múltiples epítopos GI.1 en cada individuo, incluidos epítopos en proteínas estructurales y no estructurales. Usando las muestras de sueros longitudinales, observamos que todos los individuos tenían epítopos preexistentes así como nuevos epítopos debido a la respuesta inmune adaptativa resultante de la infección por desafío GI.1. Además, el mapeo de epítopos de los sueros GI.1 y GII.4 permitió la identificación de epítopos con reactividad cruzada. En conjunto, los resultados brindan información sobre las respuestas inmunitarias humorales a la infección por HuNoV.

Las partículas similares a virus (VLP), que están compuestas por la proteína estructural principal VP1, son altamente inmunogénicas y son candidatas a vacunas debido a su inmunogenicidad y perfiles epitópicos bien estudiados39. Por el contrario, la inmunogenicidad y los paisajes de epítopos de las proteínas no estructurales de HuNoV no se han caracterizado tan bien. Sin embargo, se ha demostrado que un clon de expresión ubicado en el extremo C-terminal de NS3 (NTPasa) y el extremo N-terminal de NS4 (p22) aislado del cribado inmunológico fue reactivo con los sueros posteriores a la infección por norovirus GI.140. Otro informe mostró que las personas infectadas con un norovirus GI.1 tenían una respuesta serológica a la proteína de fusión no estructural VPR, que está compuesta por VPg, proteasa y RdRp41. Además, un estudio reciente que analizó las respuestas inmunitarias humorales contra el HuNoV en niños de toda Europa informó antigenicidad en NS1/2 (p48) y NS4 (p22)42. Nuestro trabajo amplía en gran medida la comprensión de la inmunogenicidad de las proteínas no estructurales a través de la identificación de epítopos en múltiples proteínas no estructurales, incluidas las enumeradas anteriormente. Específicamente, identificamos 13 epítopos GI.1 y seis epítopos GII.4 HOV en proteínas no estructurales.

La ubicación de los epítopos en las estructuras de proteínas proporciona pistas sobre si los anticuerpos que se unen a estos epítopos poseen actividades neutralizantes. Están disponibles estructuras de rayos X de NS6 (proteasa) y NS7 (RdRp)7,43,44,45,46 y análisis de resonancia magnética nuclear (NMR) de norovirus murino VPg y un modelo de homología de HuNoV VPg47,48. HuNoV NS5 (VPg) se une covalentemente al extremo 5 'del genoma del ARN viral y participa en el inicio de la replicación del ARN viral. Los epítopos de NS5 con reacción cruzada para GI.1 (984–1037) y GII.4 HOV (872–942) (Fig. S9) se asignan al núcleo helicoidal estructurado de VPg e incluyen un residuo de tirosina crítico (Y992 en GI.1 y Y902 en GII.4 HOV), lo que sugiere que los anticuerpos que se unen a estos epítopos pueden inhibir directamente el paso de replicación del ARN viral47.

También identificamos epítopos en HuNoV NS6 (proteasa) tanto en GI.1 como en GII.4 HOV. El epítopo NS6 detectado a partir de sueros GI.1 (1095–1180) se mapea en la hendidura de la proteasa, que incluye residuos catalíticos clave en el sitio activo (H1130 y E1154) (Fig. 9a)43,49. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos a este epítopo podrían inhibir la actividad catalítica de NS6. El epítopo GII.4 HOV NS6 (Fig. 9b) se mapea en los primeros 21 residuos y no incluye el sitio activo de la proteasa43.

Ubicación de epítopos en las estructuras GI.1 Norwalk y GII.4 HOV NS6 (proteasa), GI.1 NS7 (RdRp), GI.1 VP1 y GII.4 HOV VP1. De izquierda a derecha, se muestran cuatro diagramas de superficie girados 90˚ en sentido contrario a las agujas del reloj en el eje y y dos diagramas de superficie girados 90˚ en sentido contrario a las agujas del reloj en el eje x para la estructura a GI.1 NS6 (ID de PDB: 2FYQ), b Estructura GII.4 HOV NS6 (PDB ID: 6NIR), c Estructura GI.1 NS7 (PDB ID: 4NRT), y d GI.1 VP1 (PDB ID: 1IHM), e GII.4 VP1 (PDB ID: 7MRY) con la ubicación de los epítopos.

Identificamos cuatro epítopos en la proteína GI.1 NS7 (RdRp), que es responsable de la replicación del ARN viral. Dos de los cuatro epítopos GI.1 NS7 superponen el sitio activo de NS7 en la región de la palma (D1522, D1623, D1624)50,51 y otro epítopo incluye residuos en la región del pulgar (I1721, S1722, E1726, W1764, M1765) que interactuar con la cola C-terminal en la hendidura del sitio activo durante la replicación del ARN52 (Fig. 9c). Por lo tanto, los anticuerpos que se unen a estos epítopos de polimerasa GI.1 podrían inhibir la síntesis de ARN.

Identificamos 35 epítopos en la proteína principal de la cápside GI.1 VP1, con 19 en el dominio S, 12 en el subdominio P1 y cuatro en el subdominio P2 (Fig. 9d). Muchos epítopos se alinearon con los epítopos señalados por van Loben Sels y Green9. Los primeros cinco epítopos, que abarcan los residuos 6 a 56, están en el NTD del dominio S y son altamente inmunogénicos tal como aparecieron en los seis sujetos del estudio. Había 15 mAbs GI.1 previamente identificados que también reconocen sitios en la región 1–43 del NTD del dominio S53. Los otros 14 epítopos en el dominio S cubren la mayor parte de las ocho hebras β B a I7. Estos no han sido reportados como epítopos neutralizantes. El subdominio P2 es la región más antigénica y contiene el sitio de unión de la HBGA humana durante las infecciones virales54. Identificamos cuatro epítopos en P2. Se demostró que todos estos epítopos eran reconocidos por anticuerpos neutralizantes o bloqueadores de HBGA (Fig. 9d)5,55. La mayoría de los epítopos conformacionales unidos por anticuerpos neutralizantes como 5I2 y varios nanocuerpos (Nano-7, Nano-62 y Nano-94) también están contenidos en los epítopos 22 a 25 de GI.1 (Fig. 9d)56,57, 58.

Nuestros resultados GII.4 HOV indicaron 18 epítopos en VP1, con 10 en el dominio S, cuatro en el subdominio P1 y cuatro en el subdominio P2, con la mayoría de los epítopos identificados también discutidos por van Loben Sels y Green9. Muchos residuos en los epítopos identificados en los subdominios P1 y P2 también se conservan en los genotipos GII. Por ejemplo, una secuencia continua en el 4º y 5º epítopo en el dominio GII.4 S que se muestra en la Fig. 9e está altamente conservada en GII.4, GII.7 y GII.8 y es reconocida por MAb N2C359. El epítopo del subdominio P2 11 en la Fig. S9e también contiene varios residuos (A294, G295, S296, N298) que están altamente conservados en muchos genotipos GII.4 y son parte del epítopo A, que se identificó previamente como un epítopo de bloqueo inmunodominante60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69,70. El epítopo 12, también ubicado en el subdominio P2, contiene V327, que es un residuo altamente conservado en otro epítopo de bloqueo (epítopo F) reconocido por GII.4F, un anticuerpo monoclonal humano generado después de una infección aguda63,65,71,72,73. El epítopo 12 también contiene una parte del epítopo de bloqueo reconocido por un anticuerpo monoclonal específico de GII NORO-32074,75. Los epítopos 11 y 12 están ubicados en la parte superior de VP1 (Fig. 9e). Nuestros epítopos 16 y 17 en el subdominio P1 contienen residuos dentro de un epítopo bloqueador de HBGA que es reconocido por el anticuerpo monoclonal 3C3G3, así como por los anticuerpos monoclonales de reacción cruzada NV23, NS22 y F12076,77,78,79. Los epítopos 16 y 17 están ubicados en el lado de VP1 (Fig. 9e). Por último, nuestros epítopos 13 y 18 contienen residuos en dos epítopos de bloqueo subdominantes, C e I, que demostraron tener títulos modestos de bloqueo y neutralización70. Los epítopos en los subdominios P1 y P2 que identificamos en GI.1 y GII.4 HOV VP1 incluyen muchos residuos clave altamente conservados, con reacción cruzada y dirigidos por anticuerpos bloqueadores de HBGA. Se ha demostrado que los anticuerpos que inhiben el bloqueo de HBGA se correlacionan con la neutralización clínica GI.1 y GII.4 y la protección contra las infecciones por HuNoV10,12,80. También se confirmó que algunos epítopos antigénicos eran fuertemente neutralizantes (es decir, el epítopo A)70. Por lo tanto, los epítopos GI.1 y GII.4 HOV que contienen residuos bloqueadores de HBGA serían candidatos para su incorporación en vacunas protectoras.

Nuestros resultados muestran claramente que la infección por HuNoV provoca anticuerpos que se unen a proteínas no estructurales. Sin embargo, las proteínas no estructurales se fabrican dentro de las células infectadas por virus y no está claro cómo estas proteínas estarían disponibles para la interacción con los receptores de células B (BCR) para generar una respuesta de anticuerpos adaptativos. La lisis celular posterior a la infección podría liberar proteínas no estructurales para unirse a los receptores de linfocitos, lo que daría lugar a la producción de anticuerpos. La apoptosis de la célula infectada es un posible mecanismo para que la lisis celular libere proteínas no estructurales. Lee et al. demostraron que el norovirus murino NS1 y una forma de HuNoV NS1 son secretados81. Especularon que la secreción de NS1 está acoplada con la apoptosis ya que es facilitada por la escisión de caspasa-3. Otro estudio encontró que cuando solo las poliproteínas ORF1 del norovirus murino se expresan en un sistema de células eucariotas, se induce la apoptosis a través de la activación de la caspasa-982.

Una pregunta adicional es si los anticuerpos contra las proteínas no estructurales podrían mediar en la protección contra la infección. Como se señaló anteriormente, varios de los epítopos identificados se mapean en el sitio activo o regiones funcionales de proteínas no estructurales y podrían bloquear la actividad. Sin embargo, no está claro cómo los anticuerpos obtendrían acceso a las proteínas no estructurales ya que las proteínas funcionan dentro de las células infectadas. Otra vía por la que los anticuerpos podrían potenciar la protección es a través de sus funciones efectoras Fc. Los anticuerpos obtenidos de proteínas no estructurales pueden activar funciones efectoras mediadas por Fc que se utilizan para eliminar células infectadas por virus, incluida la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP)83.

Aunque hay informes limitados de epítopos en las proteínas no estructurales de HuNoV, varios estudios previos han demostrado que las proteínas no estructurales de otros virus son ricas en epítopos. Por ejemplo, un estudio en pacientes con COVID-19 identificó epítopos IgG en todas las proteínas accesorias y no estructurales del SARS-CoV-284. Curiosamente, los epítopos correlacionados con una mayor supervivencia del paciente se concentraron en las proteasas NSP3 y NSP5, mientras que los epítopos IgG que residen en las proteínas accesorias Spike, Nucleocapsid y ORF3a se asociaron con una mayor mortalidad84. Además, el descubrimiento de epítopos anti-NS1 de reactividad cruzada en los virus del dengue y del Zika llevó a sugerir que NS1 es una vacuna candidata viable y condujo a la protección pasiva en modelos animales85,86,87,88. Se desconoce si los epítopos de las proteínas no estructurales de HuNoV brindan protección contra la infección. Sin embargo, nuestros resultados, junto con los hallazgos con otros virus, sugieren que las proteínas no estructurales que inducen anticuerpos de reacción cruzada son candidatas para una mayor investigación y posible uso como herramienta de detección para detectar infecciones virales.

Nuestros hallazgos también demostraron la naturaleza dinámica de la respuesta longitudinal de anticuerpos en el transcurso de una infección por HuNoV. Los epítopos identificados en los sueros previos a la infección estaban presentes cuando se indujeron los epítopos de novo después de la infección para todos los sujetos del estudio. Una explicación para esta observación es que los anticuerpos inducidos por el desafío eran tanto contra la cepa GI.1 Norwalk como contra las cepas que infectaron previamente a los individuos. Estos patrones son similares al "reforzamiento" observado en la inmunología del virus de la influenza, donde se inducen respuestas inmunitarias contra los epítopos en la cepa que infecta actualmente, así como contra las cepas anteriores si los epítopos tienen una homología alta89. Esta inmunidad heterogénea donde se generan mayores títulos de anticuerpos contra epítopos conservados compartidos entre las cepas actuales y anteriores también se observó recientemente en infecciones por SARS-CoV-290,91.

Utilizamos una biblioteca de presentación de fagos genómicos GI.1 y GII.4 HOV y realizamos selecciones de afinidad contra nueve sueros humanos únicos, 12 sueros de diferentes puntos temporales de tres infecciones por HuNoV, un antisuero de conejo y un anticuerpo monoclonal scFV. La secuenciación profunda de insertos de las selecciones de afinidad identificó epítopos en muchas proteínas no estructurales. El papel de estos anticuerpos que se unen a estos epítopos, si los hay, para la inmunidad no está claro y merece un estudio futuro. Además, nuestro trabajo reveló extensos cambios longitudinales de persistencia del epítopo durante las infecciones por HuNoV. Finalmente, identificamos epítopos de reacción cruzada en sueros de individuos infectados con GI.1 y GII.4, lo que sugiere que durante la infección se obtienen anticuerpos de genogrupo cruzado. El trabajo futuro con sueros de una cohorte más extensa proporcionará una mayor comprensión de los epítopos y, por lo tanto, de la dinámica de los anticuerpos con respecto a la inmunidad contra las infecciones por HuNoV.

En este estudio se incluyeron un total de 21 muestras de suero. Seis personas que se infectaron durante un estudio de infección experimental humana GI.1 proporcionaron 18 muestras30, y tres personas con anticuerpos adquiridos de forma natural contra GII.4 NoV proporcionaron muestras individuales. Se recolectaron muestras de los sujetos 715, 720 y 723 en el estudio GI.1 dos semanas después del desafío; Se recolectaron muestras de 731, 732 y 750 antes del desafío y 1, 2, 4 y ~26 semanas después del desafío. A los sujetos 720, 723, 731 y 732 se les diagnosticó gastroenteritis después del desafío, mientras que a los sujetos 715 y 750 no se les diagnosticó30. Las muestras de suero de BCM13-1 se recolectaron en 2013, mientras que BCM16-1 y BCM16-2 se recolectaron en septiembre y mayo de 2016, respectivamente. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Baylor.

La biblioteca de presentación de fagos GI.1 pTP663 Jun-Fos que contiene insertos del plásmido pKS-NV68 KM cortado, que codifica GI.1 ORF1 a ORF3, se construyó previamente25. Se cortó un total de 12,8 μg de plásmido pKS-NV68 utilizando un ultrasonicador enfocado Covaris S2 a un rango de tamaño de 100 a 500 pb. El ADN cortado se purificó utilizando una columna de purificación Qiagen PCR y se eluyó en 50 μg de tampón Tris-Cl 10 mM (pH 8,5), lo que resultó en 56 ng/μl y 2,8 μg como concentración final y cantidad de ADN, respectivamente. Los extremos de los fragmentos de ADN de 2,8 μg resultantes se hicieron romos y se fosforilaron en un tampón que constaba de Tris-Cl 50 mM, MgCl2 10 mM, ATP 1 mM, ditiotreitol (DTT) 10 mM, desoxinucleósido trifosfato (dNTP) 0,4 mM y 15 unidades de T4. ADN polimerasa (New England Biolabs [NEB]), y 50 unidades de polinucleótido quinasa de T4 (NEB), y 5 unidades de ADN polimerasa de fragmento Klenow, en un volumen total de 100 μg. La mezcla de reacción se incubó a 20 °C durante 30 min, se purificó usando una columna de purificación Qiagen PCR y se eluyó en tampón Tris-Cl 10 mM (pH 8,5).

Para preparar los fragmentos de ADN para la ligación con el plásmido de presentación de fagos pTP663 Jun-Fos a través de la clonación AT, se añadió desoxiadenosina a los fragmentos de ADN reparados en el extremo mencionados anteriormente en una mezcla de reacción de 50 μl que contenía NaCl 50 mM, Tris-Cl 10 mM, 10 MgCl2 mM, DTT 1 mM y dATP 0,2 mM con 15 unidades de exonucleasa de ADN polimerasa Klenow (NEB). La mezcla de reacción se incubó durante 30 min a 37 °C, se purificó y eluyó en tampón Tris-Cl 10 mM (pH 8,5).

Después del crecimiento en una cepa de E. coli negativa para dam, se preparó el plásmido de presentación de fagos pTP663 Jun-Fos para la clonación mediante la purificación del ADN del plásmido utilizando un kit miniprep de Qiagen. Se digirió un total de 9 μg de ADN plasmídico con XbaI en tampón 1X NEB CutSmart a 37 ˚C durante 2 h en un volumen de 200 μl seguido de la inactivación de XbaI a 65 ˚C durante 10 min. Los extremos de ADN de los plásmidos de presentación de fagos pTP663 Jun-Fos se hicieron romos mediante la adición de 4 μl de dNTP 10 mM y 2 μl de Klenow ADN polimerasa (NEB) y la incubación a 25 ˚C durante 30 min, seguido de una incubación a 70 ˚ C durante 10 min. La mezcla de reacción se purificó y eluyó en tampón Tris-Cl 10 mM (pH 8,5). Se añadió didesoxitimidina al ADN purificado en una mezcla de reacción de 100 μl con tampón de desoxinucleotidil transferasa (TdT) terminal (NEB) 1X con CoCl2 0,25 mM, ddTTP 0,2 mM y 40 unidades de TdT (NEB). La mezcla de reacción que contenía plásmidos con cola en T se incubó durante 1 h a 37 °C seguido de 10 min a 70 °C y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa. La banda de pTP663 de 5300 pb se extrajo con un kit de purificación de gel Qiagen y se eluyó en 80 μl de tampón Tris-Cl 10 mM (pH 8,5), lo que resultó en una concentración final de 6,7 ng/μl de ADN de pTP663.

El ADN cizallado y de cola A de 100 a 500 pb (1,45 μg) se ligó con el ADN del vector pTP663 de cola T (0,13 μg) en un volumen de reacción de 250 μl de Tris-Cl 50 mM, MgCl2 10 mM, ATP 1 mM , tampón DTT 10 mM a 16 °C durante 12 h. Luego, la reacción se extrajo con fenol-cloroformo-isoamiletanol, se precipitó en 2 volúmenes de etanol al 100 % a -80 °C durante 1 h y se centrifugó a 13 000 rpm durante 15 min. El sedimento de ADN se secó y se resuspendió en tampón TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM [pH 8,0]), seguido de electroporación de 3 μl de ADN en 50 μl de células electrocompetentes E. coli XL1-Blue. Las células transformadas se seleccionaron con 100 µg/ml de ampicilina en placas de agar. El tamaño de la biblioteca se estimó por el número de recuento de colonias y el porcentaje de clones con insertos se determinó mediante secuenciación profunda de los clones individuales. Las 445.000 colonias restantes se agruparon mezclando medio LB con 100 µg/ml de ampicilina con las colonias en las placas de agar en una suspensión.

La producción de fagos a partir de las células de la biblioteca agrupadas se llevó a cabo añadiendo 0,1 ml de las células de la biblioteca agrupadas a 30 ml de medio 2YT con 100 µg/ml de ampicilina. El cultivo se incubó a 37 ˚C mientras se agitaba durante aproximadamente 3 h hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) alcanzó 0,6. Se añadió el fago auxiliar KM13 92 a 1 × 1010 fagos/ml y los cultivos se incubaron durante 30 min a 37 ˚C sin agitación y posteriormente durante 20 ha 30 ˚C con agitación. La eliminación de las células de E. coli se realizó por centrifugación y la precipitación de los fagos se realizó mediante la adición de 1/5 de volumen de polietilenglicol 6000 al 20% (PEG 6000), NaCl 2,5 M. La solución se incubó durante la noche a 4 °C, se recuperó por centrifugación y se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X. Los insertos de la biblioteca de visualización de fagos GII.4 HOV pTP663 Jun-Fos del plásmido pKS-SagaFpA50 cortado que codifica GII.4 HOV ORF1 a ORF3 se prepararon para este estudio utilizando los mismos métodos que se describen para la visualización de fagos GI.1 pTP663 Jun-Fos. biblioteca.

La primera ronda de selección por afinidad se realizó colocando 100 μl (1 mg) de perlas magnéticas Pierce Protein A/G (Thermo Scientific, n.º 88803) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y lavando con 1X TBS-T con 0,05 % de Tween- 20 Luego, se inmovilizaron 500 μl de suero humano (diluido 1:50) sobre las perlas en TBS 1X a temperatura ambiente durante 1 hora. Los sueros de anticuerpos anti-GI.1 VLP de conejo se inmovilizaron en perlas siguiendo el mismo procedimiento. El anticuerpo HJT-R3-A9 scFv se purificó previamente después de la expresión de la proteína en E. coli25,93. El anticuerpo se inmovilizó a 200 μg/ml en TBS 1X sobre las perlas a temperatura ambiente durante 1 h. Para todas las muestras, después de lavar con 1 ml de TBS-T 1X con Tween-20 al 0,05 %, los tubos se colocaron en un soporte magnético donde se recogieron las perlas magnéticas y se descartó el sobrenadante. Las perlas con suero humano inmovilizado, suero de conejo y el anticuerpo HJT-R3-A9 se lavaron tres veces con 1 ml de TBS-T 1X con Tween-20 al 0,05 % y se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 hora con 1 ml de TBS-T 1X. TBS-T con 0,05% Tween-20 y 0,5% BSA. Las perlas se lavaron tres veces con TBS-T 1X con Tween-20 al 0,05 %, y se añadieron 5 × 1011 fagos de biblioteca por tubo en TBS 1X y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación, las perlas se lavaron 3 veces con TBS-T 1X con Tween-20 al 0,05 % y los fagos se eluyeron con 500 μl por muestra de glicina 0,2 M (pH 2,2), tampón de elución de albúmina de suero bovino (BSA) 1 mg/ml y neutralizado con 100 μl de Tris 2 M (pH 8,5) por tubo. Una alícuota de los fagos eluidos (250 μl) se utilizó para infectar 1 ml de células de E. coli XL1-Blue, esta mezcla se inoculó en 50 ml de medio 2YT que contenía 100 μg/ml de ampicilina, y un total de 1010 fagos/ml, o 100 μl, del fago auxiliar M13KO7 (New England BioLabs, #N0315S), y el cultivo se incubó durante la noche a 37 °C para amplificar los fagos. Los fagos amplificados se precipitaron utilizando PEG8000/NaCl 2,5 M y se recogieron mediante centrifugación a 4 kg durante 30 min. Luego, los fagos se resuspendieron en PBS 1X y se usó una pequeña alícuota para determinar el título de fagos. Esta preparación de fagos se usó luego para la siguiente ronda de selección por afinidad.

Se realizó NGS basado en amplicón con la plataforma Illumina para determinar las secuencias de ADN de los insertos en la biblioteca ingenua y después de cada ronda de selección por afinidad25. La amplificación por PCR se realizó utilizando el fago amplificado de la biblioteca ingenua y las bibliotecas enriquecidas como plantilla. Los cebadores de PCR contenían una secuencia de código de barras de 7 pb en el extremo 5'. La secuencia del código de barras es única para cada mezcla de PCR y tiene el propósito de asignar secuencias a cada experimento. Después de la electroforesis en gel de agarosa y la extracción en gel, se extrajo el ADN, se purificó con un kit de purificación en gel de Qiagen, se combinó y se usó para Illumina NGS.

Se utilizaron secuencias de comandos Perl personalizadas en los archivos fastq de secuenciación profunda para clasificar las lecturas o inserciones en sus respectivos experimentos en función de los códigos de barras asociados con los amplicones. Luego se usó otro script Perl personalizado para alinear las secuencias de inserción con el genoma de referencia para determinar la identidad y el número de ocurrencias de cada inserción en cada biblioteca enriquecida y la biblioteca ingenua. El programa Gnuplot se usó para trazar las posiciones finales de 5 ', las posiciones finales de 3' y el número de ocurrencias de cada inserción en los ejes x, y y z, respectivamente. Los insertos con un recuento de 5 o más fueron seleccionados para la determinación de la puntuación de cobertura. Los puntajes de cobertura se determinaron utilizando el programa bedtools genomacov y se definieron como el número de ocurrencias por nucleótido para cada inserto después de la alineación con el genoma de referencia: plásmido pKS-NV68 para los experimentos GI.1 y plásmido pKS-SagaFpA50 para el GII.4 Experimentos HOV27,28,94. Se determinaron y contaron los insertos que están en el marco de GI.1 y GII.4 HOV ORF1 a ORF3 en los plásmidos pKS-NV68 y pKS-SagaFpA50. El GI.1 y GII.4 HOV ORF2 se dividieron en ventanas largas consecutivas de 8 mer. La proporción de inserciones en el marco en una ventana para la biblioteca ingenua y las bibliotecas después de las selecciones de afinidad se definió como el número de ocurrencias de las inserciones en el marco dividido por el número total de inserciones en cada ventana. La proporción de todas las inserciones en marco en la biblioteca ingenua y después de cada ronda de selección por afinidad para cada individuo se calculó dividiendo el número de inserciones en marco por el número total de inserciones en el experimento.

Se utilizó un script de Python personalizado para crear los bloques en el dendrograma. Se utilizó Seaborn, una biblioteca de visualización de datos estadísticos basada en matplotlib, para agrupar los bloques con el mapeo semántico y la agregación estadística necesarios95.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Se usaron secuencias de comandos Perl personalizadas para procesar los datos de secuenciación profunda y están disponibles en el enlace de Github: https://github.com/Palzkill-Lab/Norovirus_epitopes.

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Este trabajo fue financiado por la subvención NIH P01 AI057788 y parcialmente por U19 AI 144297. Agradecemos a Eunna Huh por la generación de la Fig. 5 y la Fig. 7 complementaria. También agradecemos a Nathaniel Jansen por su revisión del análisis computacional.

Departamento de Farmacología y Biología Química, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Lynn Su, Wanzhi Huang y Timothy Palzkill

Departamento de Virología Molecular y Microbiología, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Frederick H. Neill, Mary K. Estes y Robert L. Atmar

Departamento de Medicina, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Mary K. Estes & Robert L. Atmar

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LS realizó los ensayos de visualización de fagos, analizó los conjuntos de datos de secuenciación profunda y compuso el manuscrito. WH construyó las bibliotecas de visualización de fagos y purificó el anticuerpo utilizado en este estudio. RLA y FHN dirigieron el estudio de infección experimental en humanos en el que recolectaron y caracterizaron las muestras de suero utilizadas en este estudio. TP, MKE y RLA desarrollaron la idea conceptual del proyecto y fueron responsables de la planificación y dirección general del proyecto. TP, MKE y RLA también fueron responsables de la revisión crítica del manuscrito.

Correspondencia a Timothy Palzkill.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Su, L., Huang, W., Neill, FH et al. El mapeo de antígenos de norovirus humanos durante la infección revela la amplitud de la respuesta inmune humoral. Vacunas npj 8, 87 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

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Recibido: 12 de octubre de 2022

Aceptado: 25 de mayo de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

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